第一部分TM4基因的克隆及生物信息学分析目的:从人主动脉组织中克隆TM4基因,运用生物信息学技术对TM4基因及蛋白进行综合分析,为下一步研究工作指明方向。方法:运用RT-PCR技术克隆TM4基因全长,将TM4基因克隆到pDrive载体中,经酶切、测序证实TM4基因序列的正确性,进一步运用生物信息学技术对TM4基因及蛋白的结构、功能等进行分析。结果:1)TM4基因存在两个剪切体,其ORF分别为1035bp和915bp,主动脉组织中主要表达长剪切体。2)成功克隆出TM4基因的长剪切体并成功构建序列正确的pDriVe-TM4克隆载体。3)生物信息学分析发现:TM4基因(长剪切体)定位于13q32.3,编码344个氨基酸,广泛表达于多种组织;数据库中尚未出现与TM4基因及蛋白序列完全一致的序列,但其序列与多种物种中的UBAC2(UBA domaincontaining 2)基因及蛋白序列高度同源;TM4蛋白为含有4个穿膜结构袢的膜蛋白,在胞内段第89位丝氨酸残基上含有PKC磷酸化位点,在C末端含有一个保守的功能结构域-泛素相关结构域(Ubiquitin Associated domain,UBAdomain),UBA结构域在不同物种中高度保守;TM4可能是一个参与某种或某些物质转运的蛋白。结论:1)TM4是一个广泛表达于多种组织、存在两种剪切体的新基因。2)TM4是一个含有4个穿膜结构袢的膜蛋白,UBA结构域对TM4蛋白功能的发挥可能起重要作用。3)TM4蛋白可能参与物质转运。第二部分TM4基因真核表达载体及腺病毒表达载体的构建及鉴定目的:构建TM4基因的真核表达载体和腺病毒表达载体,为下一步TM4蛋白功能等研究奠定基础。方法:以pDrive-TM4质粒为模板,通过PCR扩增出TM4基因的ORF,将TM4基因克隆到真核表达载体PDC315及PDC315-GFP中,并用酶切、测序证实TM4基因序列的正确性,进一步用PDC315-GFP-TM4质粒转染HEK293细胞以证实质粒构建的正确性。以PDC315-GFP-TM4及PDC315-TM4质粒作为穿梭质粒,与含5型腺病毒基因组的辅助质粒pBHGloxE1,3Cre重组包装腺病毒表达载体,并经PCR及细胞感染证实病毒包装是否成功。结果:1)成功构建TM4真核表达载体PDC315-TM4及PDC315-GFP-TM4,经酶切及测序鉴定序列正确,PDC315-GFP-TM4质粒转染细胞可以正确表达GFP蛋白。2)成功包装表达TM4基因的重组腺病毒载体,经PCR及细胞感染实验证实病毒包装成功。结论:成功构建TM4真核表达载体及重组腺病毒载体。第三部分应用酵母双杂交筛选TM4蛋白的相互作用蛋白目的:应用酵母双杂交技术筛选与TM4蛋白可能存在相互作用的蛋白。方法:以pDrive-TM4质粒为模板,PCR扩增出TM4基因的ORF,构建重组酵母质粒pGB-TM4,验证TM4蛋白是否具有自激活报告基因的能力。pGB-TM4诱饵质粒转化筛库宿主菌Y190,检测诱饵基因是否激活报告基因,然后筛选酵母cDNA文库,鉴定阳性克隆,抽提酵母质粒,筛库所得猎物(Prey)质粒与诱饵(Bait)质粒共同转化Y190菌,进一步验证其相互作用。测序得到阳性克隆序列,数据库序列比对明确基因。结果:成功构建pGB-TM4重组质粒,重组质粒没有自激活报告基因的能力,在cDNA文库转化克隆中,得到5个阳性克隆,经测序及blastn比对证实均为NR4A1基因,将Prey质粒与Bait质粒共同转化Y190菌,可以激活报告基因,提示NR4A1可能为TM4蛋白的相互作用蛋白。结论:应用酵母双杂交技术筛选到TM4蛋白的可能相互作用蛋白-NR4A1,为进一步的深入研究奠定了基础。第四部分应用基因诱捕建立TM4基因突变小鼠模型目的:应用基因诱捕(gene trap)技术建立TM4基因突变小鼠模型,为进一步深入研究TM4功能奠定基础。方法:应用基因诱捕方法制备TM4基因突变小鼠模型。从基因诱捕ES细胞库获得含TM4基因突变的ES细胞株RRQ018,将ES细胞囊胚显微注射到C57BL/6J小鼠的囊胚腔中,然后将注射好的囊胚移植到假孕母鼠的输卵管中。出生仔鼠中毛色嵌合率在50%以上的小鼠为嵌合体小鼠,将雄性嵌合体小鼠与C57BL/6J雌性小鼠交配,留下灰色仔鼠剪尾做基因型分析。获得的杂合子小鼠为F1代,F1杂合子交配产下F2代小鼠,用PCR方法鉴定小鼠体内的TM4基因是否发生突变。结果:获得9只雄性嵌合体小鼠,其中编号为5号和8号的两只嵌合体雄鼠可以产下灰色仔鼠。F1代中获得TM4基因突变杂合子小鼠,F1代杂合子交配获得的F2代小鼠在DNA水平鉴定证实基因诱捕载体成功插入TM4基因的内含子中,但是在RNA水平发现TM4基因仅发生部分突变,即产生TM4基因功能部分性缺失突变,未能产生TM4基因功能完全性缺失突变。结论:建立TM4基因功能部分性缺失突变小鼠模型,未能建立TM4基因功能完全性缺失突变小鼠模型。第五部分TM4蛋白在糖尿病血管损伤中的作用初步研究目的:研究TM4蛋白在组织和血管细胞中的分布、亚细胞定位;初步研究高糖、AGEs等因素对TM4蛋白表达的影响;初步研究TM4蛋白对细胞增殖的影响;初步研究TM4基因功能部分丧失对Nur77蛋白表达的影响。方法:1)运用RT-PCR、免疫组化方法研究TM4基因的组织表达谱以及在血管细胞中的表达谱。2)应用激光共聚焦技术观察TM4蛋白的亚细胞定位。3)应用Westen blot方法观察高糖、AGEs等因素对TM4蛋白表达的影响。4)用XTT法研究TM4蛋白对细胞增殖的影响。5)用Westen blot技术观察TM4基因功能部分丧失后对Nur77蛋白表达的影响。结果:1)TM4基因广泛表达于体内多种组织,血管内皮细胞、平滑肌细胞以及巨噬细胞中均有TM4表达,TM4蛋白可表达于血管内膜、中膜及外膜。2)TM4蛋白定位于核膜及细胞膜。3)高糖、AGEs、PKC激动剂TPA上调TM4基因的表达,吡咯列酮下调TM4基因的表达。4)过表达TM4促进细胞增殖。5)TM4基因功能部分丧失后Nur77蛋白表达上调。结论:TM4基因广泛表达于多种组织,血管内皮、平滑肌及巨噬细胞均表达TM4基因,TM4的表达受高糖、AGEs等因素调控,TM4过表达促进细胞增殖,TM4基因功能部分丧失后Nur77蛋白表达上调。TM4蛋白在糖尿病血管损伤中可能起一定作用。