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肝外胆管癌是一种发生于肝外胆道系统的恶性肿瘤,肝外胆管癌恶性程度高,容易发生侵袭转移,不容易诊断,难于治疗,对放化疗不敏感是其主要临床特征。先天性胆管囊肿、原发性硬化性胆管炎和胆石症等是肝外胆管癌的主要诱发因素。在全球范围内,胆管癌的发病率有逐渐上升趋势,虽然近年来肝外胆管癌在诊断和治疗等方面的研究有一定突破,但进展缓慢,胆管癌的发生发展以及侵袭转移具体机制仍不明确,仍然缺少对肝外胆管癌有效的诊断和治疗靶点。因此,进一步寻找生物靶标,将对肝外胆管癌的诊断和治疗以及患者预后的判断带来深远的影响。最近,针对microRNA与肿瘤的关系研究逐渐增多,成为科研热点难点。miRNAs是一种RNA,它们具有重要功能,却不编码蛋白质,约21-25nt大小的单链。microRNA具有特殊特异性结合靶基因来调控其表达。microRNA的异常表达不仅参与调解正常人体的多种生物学功能,目前研究发现miRNAs还与肿瘤的发生、发展密切相关,甚至参与调解恶性肿瘤的侵袭转移进程。在不同的肿瘤类型中,不同种类的microRNA呈现抑癌基因和癌基因的不同角色。其主要的作用机制包括:表观遗传水平改变,microRNA位点的缺失、扩增、突变,转录调控因子的异常表达等。研究表明,miR-221在脑胶质瘤、胃癌、肝癌、前列腺癌、乳腺癌等多种恶性肿瘤的发生发展以及侵袭转移过程中发挥重要调控作用。然而,miR-221在肝外胆管癌中的表达模式及发挥作用迄今未见报道。PTEN（phosphatase and tensin homolog deleted on chromosome 10）,又称为MMAC1（mutated in multiple advanced cancers,MMAC1）,它一种抑癌基因,在1997年被发现。PTEN定位于人染色体10q23,其抑癌作用依赖于能使脂类去磷酸化这种特性。继p53基因之后,PTEN是人类肿瘤中最常突变的抑癌基因之一,在人类多数恶性肿瘤的发生发展中起关键的抑癌作用,受到国内外学者的广泛关注。然而,在人肝外胆管细胞癌侵袭转移的作用中,PTEN的研究报道较少。本课题利用PCR技术比较了25例肝外胆管癌组织与癌旁组织中miR-221以及其相关下游靶基因的表达情况,发现miR-221在肝外胆管癌患者肿瘤组织以及胆管癌细胞系中表达显著上调。我们推测miR-221在肝外胆管癌组织中表达明显增高,可能发挥癌基因的作用;其与肝癌胆管癌的发生发展以及侵袭转移过程中发挥重要的作用。本课题组的前期实验已经阐述了miR-221具有促进肝外胆管癌的侵袭转移的作用,但是其具体的作用机制尚不明确,需要我们进一步深入研究。通过生物信息学在线基因预测软件分析我们发现PTEN的3’UTR存在一段保守的miR-221结合位点,这提示PTEN可能是miR-221的下游靶基因之一。同时,有实验证实β-catenin/c-Jun信号通路可促进miR-221的表达,而PTEN又是β-catenin/c-Jun信号通路的关键调节因子。综上所述,β-catenin/c-Jun信号通路可以转录激活miR-221,同时PTEN自身受到miR-221转录后抑制调控,我们推论PTEN-miR-221之间可能存在反馈调节环路。生理状态下,细胞不需要过多的PTEN蛋白表达,PTEN受miR-221转录后抑制;过多的PTEN可通过转录激活产生更多的miR-221,抑制PTEN而达到维持miR-221-PTEN间稳态平衡。肝外胆管癌细胞系中,PTEN表达降低而miR-221表达增高,并通过β-catenin/c-Jun信号通路抑制PTEN表达,细胞内持续增高积累的c-Jun蛋白又促进miR-221表达,形成一条正反馈调节通路,不断诱导肝外胆管癌细胞发生上皮间质转化,促进肝外胆管癌侵袭转移。本课题通过两部分来研究miR-221-β-catenin/c-Jun反馈调节环路在肝外胆管癌发生、发展、侵袭转移中的作用机制以及临床表达意义。第一部分:miR-221以及PTEN在肝外胆管癌组织、细胞系中的表达情况和二者关系的研究,并深入探讨二者在肝外胆管癌发生、发展、侵袭转移中的作用机制:（1）miR-221、PTEN在肝外胆管癌组织和细胞中的表达;（2）miR-221靶向调控下游基因PTEN;（3）miR-221是肝外胆管癌患者预后影响因素之一。第二部分:β-catenin/c-Jun信号通路参与miR-221调节的肝外胆管癌细胞系上皮间质转化,促进肝外胆管癌侵袭转移,并形成miR-221-β-catenin/c-Jun反馈调节环路:（1）β-catenin/c-Jun信号通路参与miR-221调节的肝外胆管癌细胞系上皮间质转化;（2）β-catenin/c-Jun信号通路参与miR-221调节的肝外胆管癌细胞侵袭转移;（3）β-catenin/c-Jun信号通路诱导miR-221的表达。第1部分miR-221以及PTEN在肝外胆管癌组织、细胞系中的表达情况和二者关系的研究,并深入探讨二者在肝外胆管癌发生、发展、侵袭转移中的作用机制第1节miR-221及其下游基因PTEN、β-catenin、c-Jun在肝外胆管癌组织和细胞系中的表达情况目的:研究肝外胆管癌组织和细胞系中miR-221、PTEN、β-catenin和cJun的表达水平。方法:首先,通过实时定量RT-PCR法,在肝外胆管癌组织和癌旁组织样品中miR-221的表达水平,检测胆管癌细胞系和正常胆管上皮细胞中miR-221的表达水平。其实,在肝外胆管癌组织和癌旁组织样品检测miR-221相关基因PTEN、β-catenin、c-Jun mRNA水平,并分析miR-221与PTEN的关系。结果:与癌旁组织相比,肝外胆管癌组织中miR-221水平显著上调。与正常胆管上皮细胞系HiBECs相比,胆管癌细胞系QBC939,HuCCT1,RBE,HCCC9810中miR-221表达水平显著增高。与癌旁组织相比,肝外胆管癌组织中PTEN mRNA表达水平显著下调;与正常胆管上皮细胞系HiBECs相比,胆管癌细胞系QBC939,HuCCT1,RBE,HCCC9810中PTEN mRNA表达水平明显下调,β-catenin、c-Jun mRNA表达水平明显上调。结论:肝外胆管癌组织和胆管癌细胞中,miR-221表达水平显著提高,而PTEN的表达水平显著降低。这些实验结果提示miR-221和PTEN可能参与调节肝外胆管癌的发生、发展过程。第2节mi R-221在肝外胆管癌细胞系中靶向调控下游基因PTEN目的:验证在肝外胆管癌细胞系中PTEN为mi R-221的下游靶基因。方法:1.我们运用Targetscans/PICTAR等基因预测软件预测PTEN为mi R-221的下游靶基因之一。2.构建含有萤火虫荧光素酶表达的载体,我们在p MIRREPORTER Luciferase vector载体内,将PTEN的3’UTR区包含可能与mi R-221结合的一段特殊序列克隆至其中,即PTEN野生型(PTENWT-luc)荧光素酶报告基因质粒。采用点突变的方法使PTEN的3’UTR区包含可能与mi R-221结合的一段碱基序列发生基因突变,即构建PTEN突变型(PTENMUT-luc)荧光素酶报告基因质粒。采取脂质体转染的方法,将PTENWT-luc和PTENMUT-luc分别与mi R-221模拟物（mi R-221 mimics）和阴性对照（Negative control）同时转染到QBC939和HUCCT1细胞内。48小时后收集细胞,检测实验结果。本实验以海肾荧光素酶作为内参,釆取双荧光素酶报告基因系统,检测萤火虫荧光素酶的活性,相对表达量数值即海肾荧光素酶与萤火虫荧光素酶活性的比值。3.采用脂质体转染的方法将化学合成并化学修饰的mi R-221反义核酸（mi R-221 inhibitor）或者阴性对照（Negative control）转染至QBC939和HUCCT1细胞内。成功转染后的细胞被收集后提取总蛋白,检测PTEN蛋白表达水平,采用蛋白质印迹方法检测。结果:1.mi R-221通过结合3’UTR区抑制靶基因PTEN的表达,PTEN是mi R-221的下游靶基因之一。2.mi R-221 inhibitor可明显抑制胆管癌细胞系中mi R-221的表达3.转染mi R-221反义核酸的胆管癌细胞系QBC939和HUCCT1中PTEN的蛋白表达量升高。结论:在胆管癌细胞系QBC939和HUCCT1中,PTEN是mi R-221的下游靶基因,mi R-221通过结合PTEN的3’UTR区抑制靶基因PTEN蛋白水平表达。第3节mi R-221通过抑制PTEN表达诱导肝外胆管癌细胞上皮间质转化,促进肝外胆管癌侵袭转移目的:验证mi R-221通过抑制PTEN表达诱导肝外胆管癌细胞上皮间质转化,促进肝外胆管癌侵袭转移。方法:1.采用脂质体转染的方法将化学合成并化学修饰的mi R-221反义核酸（mi R-221 inhibitor）、阴性对照（Negative control）以及PTEN si RNA转染至QBC939和HUCCT1细胞内,采用Transwell迁移侵袭小室方法检测胆管癌细胞QBC939和HUCCT1的迁移侵袭能力。2.采用脂质体转染的方法将化学合成并化学修饰的mi R-221反义核酸（mi R-221 inhibitor）或者阴性对照（Negative control）以及PTEN si RNA转染至QBC939和HUCCT1细胞内,倒置荧光显微镜下,样本进行拍照,观察细胞形态紧密连接程度,评估细胞上皮间质转化程度。3.采用脂质体转染的方法将化学合成并化学修饰的mi R-221反义核酸（mi R-221 inhibitor）或者阴性对照（Negative control）以及PTEN si RNA转染至QBC939和HUCCT1细胞,收集细胞后提取总蛋白,采用蛋白质印迹法（Western blot）检测PTEN、β-catenin、c-Jun、MMP-2、E-cadhenin、N-cadhenin以及内参β-actin蛋白表达水平。结果:1.转染mi R-221特异性抑制剂的胆管癌细胞系迁移侵袭能力明显降低;沉默PTEN表达的胆管癌细胞系迁移侵袭能力增强;同时转染mi R-221 inhibitor并沉默PTEN表达的胆管癌细胞系迁移侵袭能力增强。2.转染mi R-221特异性抑制剂的胆管癌细胞间链接变得紧密,细胞形态呈卵圆形;沉默PTEN表达的胆管癌细胞系细胞间链接趋于疏松,细胞间出现伪足,细胞呈多角型或梭型改变;同时转染mi R-221 inhibitor并沉默PTEN表达的胆管癌细胞系细胞间链接相对疏松,细胞呈间质形态改变。3.转染mi R-221 inhibitor的胆管癌细胞PTEN、E-cadhenin蛋白表达升高,β-catenin、c-Jun、MMP-2、N-cadhenin蛋白表达降低;沉默PTEN的胆管癌细胞系PTEN、E-cadhenin蛋白表达降低,β-catenin、c-Jun、MMP-2、N-cadhenin蛋白表达升高;同时转染mi R-221 inhibitor并沉默PTEN表达的胆管癌细胞系PTEN、E-cadhenin蛋白表达降低,β-catenin、c-Jun、MMP-2、N-cadhenin蛋白表达升高。结论:mi R-221通过抑制PTEN表达诱导肝外胆管癌细胞上皮间质转化,促进肝外胆管癌侵袭转移。第2部分β-catenin/c-Jun通路在mi R-221调节肝外胆管癌侵袭转移过程中发挥作用的研究第1节β-catenin/c-Jun信号通路参与mi R-221诱导肝外胆管癌细胞上皮间质转化,促进肝外胆管癌侵袭转移目的:验证β-catenin/c-Jun信号通路参与mi R-221诱导肝外胆管癌细胞上皮间质转化,促进肝外胆管癌侵袭转移方法:1.采用脂质体转染的方法将化学合成并化学修饰的mi R-221反义核酸（mi R-221 inhibitor）、阴性对照（Negative control）以及β-catenin信号通路激活剂BIO加入QBC939和HUCCT1细胞内,采用Transwell迁移侵袭小室方法检测胆管癌细胞迁移侵袭能力。2.采用脂质体转染的方法将化学合成并化学修饰的mi R-221反义核酸（mi R-221 inhibitor）、阴性对照（Negative control）以及β-catenin信号通路激活剂BIO加入QBC939和HUCCT1细胞内,倒置荧光显微镜下拍照,观察细胞形态改变细胞连接程度是否紧密、疏松,评估细胞上皮间质转化程度。3.采用脂质体转染的方法将化学合成并化学修饰的mi R-221反义核酸（mi R-221 inhibitor）、阴性对照（Negative control）以及β-catenin信号通路激活剂BIO加入QBC939和HUCCT1细胞内,收集细胞后提取总蛋白,采用蛋白质印迹法（Western blot）检测PTEN、β-catenin、c-Jun、MMP-2、E-cadhenin、N-cadhenin以及内参β-actin蛋白表达水平。结果:1.转染mi R-221 inhibitor的胆管癌细胞系迁移侵袭能力明显降低;加入BIO激活β-catenin信号通路的胆管癌细胞系迁移侵袭能力增强;同时转染mi R-221 inhibitor并加入BIO激活β-catenin信号通路的胆管癌细胞系迁移侵袭能力增强。2.转染mi R-221 inhibitor的胆管癌细胞间连接变得紧密,细胞形态呈卵圆形;加入BIO激活β-catenin信号通路的胆管癌细胞间链接趋于疏松,细胞间出现伪足,细胞呈多角型或梭型改变;同时转染mi R-221 inhibitor并加入BIO激活β-catenin信号通路的胆管癌细胞间链接变得疏松,细胞呈间质形态改变。3.转染mi R-221 inhibitor的胆管癌细胞PTEN、E-cadhenin蛋白表达升高,β-catenin、c-Jun、MMP-2、N-cadhenin蛋白表达降低;加入BIO激活β-catenin信号通路的胆管癌细胞系PTEN、E-cadhenin蛋白表达降低,β-catenin、c-Jun、MMP-2、N-cadhenin蛋白表达升高;同时转染mi R-221 inhibitor并加入BIO激活β-catenin信号通路的胆管癌细胞系PTEN、E-cadhenin蛋白表达升高,β-catenin、c-Jun、MMP-2、N-cadhenin蛋白表达降低。结果:β-catenin/c-Jun信号通路参与mi R-221诱导肝外胆管癌细胞上皮间质转化,促进肝外胆管癌侵袭转移第2节β-catenin/c-Jun信号通路促进mi R-221的表达目的:验证β-catenin/c-Jun信号通路促进mi R-221表达方法:1.实验对象选取QBC939和HUCCT1细胞,采用RNA沉默方法将c-Jun表达沉默（c-Jun si RNA）,加入BIO,即β-catenin信号通路激活剂,培养48小时后,洗涤消化收集细胞,并提取总蛋白,采用蛋白质印迹法检测c-Jun蛋白表达水平,采用β-actin蛋白表达水平作为内参对照。2.实验对象选取QBC939和HUCCT1细胞,采用RNA沉默方法将c-Jun表达沉默（c-Jun si RNA）,加入BIO,确认β-catenin信号通路被激活,利用q RT-PCR方法检测mi R-221表达水平。结果:1.在QBC939和HUCCT1细胞系中,沉默c-Jun组c-Jun蛋白表达明显降低,加入BIO激活入β-catenin信号通路激组c-Jun蛋白表达明显增高。2.在QBC939和HUCCT1细胞系中,沉默c-Jun组mi R-221表达明显降低,加入BIO激活入β-catenin信号通路激组mi R-221表达明显增高;同时沉默c-Jun并加入BIO组mi R-221表达下调。结论:β-catenin/c-Jun信号通路促进mi R-221的表达