【摘 要】
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目的:酒精作为一种精神活性物质,在生活中应用广泛,其一定浓度的摄入可以影响人类情绪、思维、行为及意识状态。研究表明酒精可能够对脑内调控睡眠觉醒的神经核团产生影响,而臂旁核作为重要的睡眠觉醒调控核团,很可能受到酒精的影响发挥其睡眠觉醒的调控作用。因此,本实验将通过离体膜片钳技术,在脑片水平上探究酒精对臂旁核谷氨酸能神经元的作用及其机制。方法:⑴急性脑片的制作:使用震动切片机将6～8周龄的雄性C57B
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目的:酒精作为一种精神活性物质,在生活中应用广泛,其一定浓度的摄入可以影响人类情绪、思维、行为及意识状态。研究表明酒精可能够对脑内调控睡眠觉醒的神经核团产生影响,而臂旁核作为重要的睡眠觉醒调控核团,很可能受到酒精的影响发挥其睡眠觉醒的调控作用。因此,本实验将通过离体膜片钳技术,在脑片水平上探究酒精对臂旁核谷氨酸能神经元的作用及其机制。方法:⑴急性脑片的制作:使用震动切片机将6～8周龄的雄性C57BL/6J野生型小鼠脑组织切成厚度为280μm的含有臂旁外侧核（the lateral parabrachial nucleus,LPB）和臂旁内侧核（the medial parabrachial nucleus,MPB）两个亚区神经元的急性脑片。⑵臂旁核谷氨酸能神经元的分型:钳住目标神经元后,注入负向电流刺激,电流强度为500 ms,随后根据其电生理特性对所记录的神经元进行分类。⑶在全细胞电流钳模式下,记录不同浓度的酒精对LPB和MPB中谷氨酸能神经元的自发放电及膜电位变化。⑷不同浓度的酒精对LPB和MPB中谷氨酸能神经元的抑制性递质传入的影响:首先,在灌流液中加入D-AP5和NBQX,将目标神经元NMDA型和AMPA型谷氨酸受体阻断,在全细胞电压钳模式下,记录自发抑制性突触后电流（spontaneous inhibitory postsynaptic currents,s IPSCs）;在上述灌流液基础上加入TTX,阻断Na+通道,在全细胞电压钳模式下,记录微小性抑制性突触后电流（miniature inhibitory postsynaptic currents,m ISPCs）。⑸不同浓度的酒精对LPB和MPB中谷氨酸能神经元的兴奋性递质传入的影响:首先,在灌流液中加入PTX,将目标神经元GABAA受体阻断,在全细胞电压钳模式下,记录自发兴奋性突触后电流（spontaneous excitatory postsynaptic currents,s EPSCs）;在上述灌流液基础上加入TTX,阻断Na+通道,在全细胞电压钳模式下,记录微小性兴奋性突触后电流（miniature excitatory postsynaptic currents,mEPSCs）。结果:⑴臂旁核谷氨酸能神经元的分型结果:所记录的LPB中谷氨酸能神经元共分为两种类型,第一种为无Ih电流的神经元,第二种为有Ih电流的神经元,且酒精对这2种神经元的作用无差别;MPB中谷氨酸能神经元同样分为有Ih电流和无Ih电流2种类型,且酒精对这2种神经元的作用无差别。⑵36 mM的酒精对LPB中谷氨酸能神经元动作电位的放电频率没有显著影响,但增加了MPB中谷氨酸能神经元动作电位的放电频率;60 mM的酒精明显降低了LPB和MPB中谷氨酸能神经元动作电位的放电频率;180 mM的酒精完全抑制了LPB和MPB中谷氨酸能神经元动作电位的放电频率,并且显著降低了LPB和MPB中谷氨酸能神经元的膜电位。⑶不同浓度的酒精对LPB和MPB中谷氨酸能神经元的抑制性递质传入的影响:36 mM的酒精对LPB中谷氨酸能神经元s IPSCs和m IPSCs没有显著影响,但是降低了MPB中谷氨酸能神经元s IPSCs和m IPSCs的放电频率和幅度;60 mM的酒精增加了LPB中谷氨酸能神经元s IPSCs的放电频率以及m IPSCs的放电频率和幅度,并且增加了MPB中谷氨酸能神经元s IPSCs和m IPSCs的放电频率和幅度;180 mM的酒精增加了LPB和MPB中谷氨酸能神经元s IPSCs和m IPSCs的放电频率和幅度。⑷不同浓度的酒精对LPB和MPB中谷氨酸能神经元的兴奋性递质传入的影响:36 mM的酒精对LPB中谷氨酸能神经元s EPSCs和mEPSCs没有显著影响,但是增加了MPB中谷氨酸能神经元s EPSCs和mEPSCs的放电频率和幅度;60 mM和180mM的酒精均降低了LPB和MPB中谷氨酸能神经元s EPSCs和mEPSCs的放电频率和幅度。结论:36 mM的酒精对于MPB中谷氨酸能神经元的兴奋作用可能是通过抑制其神经元的抑制性输入并且增强其神经元的兴奋性输入来实现的,具体表现为:减弱其突触前GABA递质的释放和突触后的GABAA受体的开放,并且增强其突触前谷氨酸递质释放特性和突触后谷氨酸受体的开放;60 mM和180 mM的酒精对于LPB和MPB中谷氨酸能神经元的抑制作用可能是通过增强其神经元的抑制性输入并且抑制其神经元的兴奋性输入来实现的,具体表现为:增强其突触前GABA递质的释放和突触后的GABAA受体的开放,并且减弱其突触前谷氨酸递质释放特性和突触后谷氨酸受体的开放。
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