研究背景和目的常染色体显性多囊肾病（autosomaldominantpolycystickidneydisease,ADPKD）是最常见的遗传性肾病之一,其病理特征是双侧肾脏生成众多进行性增大的液性囊泡，最终肾脏的正常结构和功能被严重破坏，导致肾脏功能衰竭。国外资料表明ADPKD的发病率为1/500~1/1000，至60岁时，有50%以上的患者进入终末期肾衰竭，占所有引起终末期肾衰竭病因的5%～10%。据初步估算，我国目前大约有150万ADPKD患者。上海透析登记资料表明，ADPKD是造成终末期肾衰竭的第四位病因，约为5.4%。除引起肾衰竭外，ADPKD还可以累及多种肾外器官，如多囊肝、结肠憩室、颅内动脉瘤、心脏瓣膜病、胰胆管扩张等疾病。因此，ADPKD也被公认为一种系统性疾病。目前已知，引起ADPKD的主要致病基因有pkd1和pkd2两个，其表达产物分别为多囊蛋白-1（polycistin1，PC-1）和多囊蛋白-2（polycistin,2，PC-2）。多囊蛋白-1和多囊蛋白-2结构和功能异常引起肾囊肿衬里上皮细胞类肿瘤样的持续增殖；细胞极性改变；分泌入囊腔的液体量大于重吸收量，液体在肾囊肿内积聚；以及肾间质炎症、纤维化及血管异常增生等。由此，肾脏囊肿不断生成，原有囊肿体积不断增大，压迫正常肾组织，破坏其原有结构和功能，最终导致终末期肾病。其中囊肿衬里上皮细胞过度增殖是其重要发病机制之一，ADPKD也因此被认为是一种类肿瘤疾病。ADPKD的致病机制复杂，主要的致病机制有mTOR信号转导通路的异常激活；抗利尿激素V2受体-cAMP信号转导上调；纤毛机械-钙离子内流障碍等。作为一种类肿瘤性疾病，ADPKD的发声及发展与多种调控细胞生长的信号通路密切相关。mTOR信号通路是与细胞异常增殖、肿瘤发生密切相关的通路之一。近些年来研究发现mTOR信号通路的异常在ADPKD发病过程中起到了重要作用。哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（mammaliantargetofrapamycin,mTOR）是高度保守的非典型丝氨酸／苏氨酸激酶，为磷酸肌醇激酶相关激酶(phosphoinositidekinase-relatedkinase，PIKK)家族成员之一。根据核心组成部分不同，可分为mTORC1和mTORC2两种复合体。mTORC1及其下游信号转导分子的作用主要为调节细胞生长及代谢。mTORC2及其下游信号转导分子主要调节细胞骨架中的肌动蛋白合成及细胞凋亡。mTOR通路的调节机制复杂，mTORC1与mTORC2、mTORC1与其负反馈通路之间均存在着相互调节关系。激活mTORC1通路可以通过其下游核糖体S6激酶（S6K）抑制mTORC2-Akt通路，也能通过PI3K-Akt通路反馈激活TSC1/2复合体，对mTORC1通路起反馈调节作用。正常情况下，多囊蛋白1对mTORC1及mTORC2通路均起抑制作用。当多囊蛋白发生结构和功能异常时，mTORC1通路及mTORC2通路激活，引起肾囊肿衬里上皮细胞异常增殖和去分化，导致囊肿生成及增长。雷帕霉素能够特异性抑制mTORC1，多项动物实验研究发现使用雷帕霉素特异性抑制mTORC1信号转导通路，能抑制多囊肾病模型肾囊肿的形成和增大。但是近年来的前瞻性多中心临床研究发现，单独使用雷帕霉素及其衍生物并不能延缓ADPKD患者肾功能的损害，也不能改善其预后。PPARγ属于配体依赖性核转录因子超家族，可以在包括肾脏及肝脏的多种组织内表达。PPARγ激动剂除了可以对代谢的调节，用于糖尿病的治疗外，还能通过抑制细胞增殖，诱导细胞凋亡，抑制炎症因子的产生、细胞外基质的形成及抑制新生血管的形成，从而具有抗肿瘤、抗纤维化、抗炎症的作用。近年来研究发现，PPARγ激动剂还能通过β-catenin,c-Myc,CFTR,MCP-1,ERK及TGF-β等信号通路的作用抑制多囊肾的进展。因此，本研究旨在观察mTOR通路分子在ADPKD肾组织中的表达变化，观察联合应用雷帕霉素及罗格列酮对多囊肾大鼠模型的治疗作用及其对mTOR通路信号分子的影响，并探讨联合应用雷帕霉素及罗格列酮对肾囊肿衬里上皮细胞过度增殖的影响及其作用原理，为临床工作寻找治疗常染色体显性多囊肾病的有效药物提供实验及理论依据。实验方法1.留取不同周龄的雄性杂和型Han:SPRD杂合型大鼠及野生型Han:SPRD大鼠的血液标本、肾组织，进行生化分析及组织学分析，观察不同周龄Han:SPRD杂合型大鼠肾功能的变化以及肾脏的形态学改变；2.使用免疫印迹法检测不同周龄雄性Han:SPRD大鼠杂合型大鼠肾组织中mTOR、p70S6K及其相应磷酸化蛋白表达的变化以及与野生型大鼠的表达差异；3.使用免疫印迹法检测了ADPKD患者及正常人肾组织中mTOR、p70S6K及其相应磷酸化蛋白的表达的差异；4.单独及联合使用不同剂量雷帕霉素及罗格列酮作用于雄性Han:SPRD杂合型大鼠24周，留取血液标本、肾组织，进行生化分析及组织学分析，以观察联合用药对大鼠肾功能的保护作用以及大鼠组织学改变；5.免疫组化检测核增殖抗原PCNA以及mTOR通路下游分子p70S6K的表达，以观察联合用药对细胞增殖的影响以及对mTOR通路的调控；6.使用免疫印迹法检测雄性杂合型Han：SPRD大鼠肾组织中mTOR信号通路转导分子的表达水平变化，以观察罗格列酮及雷帕霉素对多囊肾大鼠模型mTOR信号通路的影响；7.使用MTT法检测单独及联合使用罗格列酮及雷帕霉素干预WT9-12细胞培养后对细胞增殖的影响；8.使用流式细胞术检测单独及联合使用罗格列酮及雷帕霉素干预于WT9-12细胞培养后对细胞凋亡及细胞周期的影响；9.使用免疫印迹法检测WT9-12细胞中mTOR信号通路转导分子的表达水平变化，以观察使用罗格列酮及雷帕霉素干预后对WT9-12细胞中mTOR信号通路相关蛋白表达的影响。10.在分别单独及联合使用雷帕霉素、罗格列酮干预WT9-12细胞培养的基础上，加用PI3K特异性抑制剂LY294002，以观察在阻断mTORC1负反馈途径的情况下，罗格列酮对磷酸化Akt、ERK表达的影响。结果1.留取不同周龄的雄性杂合型Han:SPRD大鼠血液标本、肾组织，经生化分析及组织学分析发现在4周龄时，雄性杂合型大鼠肾功能与野生型大鼠的肾功能改变无显著差异，此后雄性杂合型大鼠的肾功能迅速衰退，12周时杂合型大鼠的血尿素氮与野生型大鼠产生显著性差异（13.19±1.38vs7.28±1.60），20周后肾功能减退速度趋缓；其囊肿指数增加及肾重/体重比的下降变化规律与肾功能的变化类似。2.采用免疫印迹法检测不同周龄大鼠肾组织发现在雄性杂合子Han:SPRD大鼠肾脏组织中磷酸化mTOR、磷酸化p70S6K蛋白表达量较野生型Han:SPRD大鼠肾组织明显升高，不同周龄的大鼠均处于激活状态，但激活程度与大鼠周龄无关。3.采用免疫印迹法检测了ADPKD患者及正常人肾组织发现在ADPKD患者肾组织中磷酸化mTOR、p70S6K的表达水平均较正常对照肾组织明显增高。4.体内实验证实雷帕霉素与罗格列酮联合应用，与雷帕霉素单独应用相比，可以更显著的抑制囊肿的发生、发展，降低大鼠的肾重/体重比；且能显著改善大鼠肾功能。同时发现联合用药可以较小用药剂量获得更好的治疗效果，小剂量雷帕霉素（0.5mg/kg）与罗格列酮合用后即可获得类似单用雷帕霉素（2mg/kg）的治疗效果（血尿素氮，21.96vs21.59,P>0.05）。此外，罗格列酮还能够改善由雷帕霉素引起的高脂血症，显示出联合用药不但效果较单独用药好，还有很好的安全性及更少的副作用。联合用药后可以更明显的改善囊肿指数，亦可改善肾间质炎细胞浸润及间质纤维化。5.肾组织核增殖抗原PCNA免疫组化检测结果发现联合用药均可以明显抑制细胞增殖，相较于单独用药组也有更好的效果。70S6K为mTOR信号通路的下游分子，免疫组化检测结果显示，雷帕霉素及罗格列酮均可降低p70S6K着色的阳性细胞数，联合用药的后小剂量组能进一步降低p70S6K着色的阳性细胞数，其中小剂量雷帕霉素（0.5mg/kg）与罗格列酮联用组效果尤其明显，与单独使用罗格列酮（4.65±2.74vs11.17±3.60）或小剂量雷帕霉素（4.65±2.74vs10.60±3.65）均有显著性差异。6.Westernblotting分析结果显示联合使用罗格列酮后，Akt及ERK的磷酸化水平均显著降低，提示罗格列酮可能拮抗由雷帕霉素引起的mTORC1负反馈通路及mTORC2通路激活。罗格列酮可明显增强雷帕霉素的疗效可能与此有关。7.MTT法检测发现使用罗格列酮及雷帕霉素均能降低囊肿衬里上细胞增殖率，其中罗格列酮100μM干预细胞72小时可以使细胞增殖率降低至54.53±4.22%，雷帕霉素100ng/ml干预细胞72小时可以使细胞增殖率降低至55.22±2.13%，两者联合使用可以进一步抑制囊肿衬里上细胞增殖率至45.96±1.21%，组间比较均有统计学差异。8.流式细胞术分析发现单用雷帕霉素可以促进细胞凋亡，单独使用罗格列酮相对于对照组并不能促进细胞凋亡，但与雷帕霉素联用后却可以显著加强雷帕霉素诱导细胞凋亡的效果；同时发现罗格列酮及雷帕霉素分别单独使用均能够抑制细胞周期，使更多细胞处于G0/G1期，两者联合使用可以使其对细胞周期抑制的作用更加明显。9.采用Westernblotting方法分析罗格列酮及雷帕霉素干预后，WT9-12细胞中mTOR信号通路相关蛋白磷酸化Akt、ERK的表达，可以发现单独使用罗格列酮即可降低其表达，与雷帕霉素联合使用后可以显著减弱由雷帕霉素引起的磷酸化Akt、ERK蛋白的上调，提示罗格列酮可能通过对PI3K的抑制发挥作用。10.在分别单独雷帕霉素、罗格列酮及其联合使用作用于WT9-12细胞的基础上，加用PI3K特异性抑制剂LY294002，观察在阻断mTORC1负反馈途径的基础上，罗格列酮对磷酸化Akt、ERK表达的影响。发现在此基础上使用罗格列酮可以进一步降低磷酸化Akt蛋白的表达水平，却无法使磷酸化ERK的表达水平进一步下降。这样的结果显示罗格列酮还可以通过mTORC1负反馈环路之外的途径对Akt的起到抑制作用。结论在ADPKD发生和发展过程中肾组织内mTOR信号通路异常激活，并通过其下游分子S6K活性的增强导致细胞异常增殖和细胞凋亡的抑制。体内实验证实使用罗格列酮联合雷帕霉素治疗Han：SPRD大鼠可以获得比单独使用雷帕霉素或罗格列酮更好的治疗效果，并显示出很好的安全性。体外实验发现联合用药的协同作用可能与罗格列酮对mTORC1负反馈通路及mTORC2通路共同的关键分子Akt的抑制有关。