目的:急性肺损伤(acute lung injury,ALI)/急性呼吸窘迫综合征(acute respiratory distress syndrome,ARDS)是指由心源性以外的各种肺内外因素导致的急性、进行性呼吸衰竭。其发病急、病情重,死亡率高,临床上主要表现为难治性低氧血症、非心源性肺水肿、肺动脉高压而体循环低血压。其主要病理生理特点之一为急性肺水肿(acute pulmonary edema,APE)。该现象是指由于各种病因导致超常的液体积蓄于肺间质和/或肺泡内,形成间质性和/或肺泡性肺水肿。而在对抗发生肺水肿的过程中,肺泡上皮细胞发挥着不可替代的作用。由于各种直接或间接的作用导致肺泡上皮细胞受到损伤时,其生理活性丧失:除表面活性物质减少外,细胞正常容积发生改变,肺泡肺泡细胞膜对于液体的转运功能出现障碍,从而导致肺泡不能清除多余的液体导致水肿加重。而后两者的作用又与肺泡细胞膜表面的离子通道有着密切的关系。在众多的离子通道当中,钠通道对于肺泡液体清除的作用已经被证实。刘琳等在其实验中也证实了肺泡上皮细胞中存在着水通道1(AQP1),并且其在ARDS状态下显著下降[1]。而做为生物体内含量丰富的氯离子通道却一直被人们所忽视。直到近年来人们才逐渐对氯离子通道关注起来。先后发现了钙激活氯通道(Currents mediated by calcium-activated chloride channels (CaCCs))、容积(或称体积)调控性氯通道(Volume-regulated anion channels,VRAC,ICl. swell)通道、电压门控性氯通道(votage2gated chloride channels ClC family)、cAMP/蛋白酶激活的氯通道、配体激活的氯通道等。其功能多种多样,其中有少数关于CFTR (cyctic fibrosis transmembrane conductance regulator)钙激活氯离子通道在肺泡液体清除中的报道。也有容积调控性氯通道对细胞正常生理功能的维持作用。但是尚未有足够的人重视起其在急性肺损伤过程中的作用。本课题选择了TMEM16A作为研究的对象。因为TMEM16A是2008年才被正式报道的一种新颖的钙激活氯离子通道,主要有以下几个特点:1作用众多。如对小鼠气道的形成,减少气道粘液分泌,信号传导等方面均有作用,并且兼有容积调控功能。2人体内含量丰富,并且在多种组织表达。3有可用的特异阻断剂,如尼氟灭酸(NFA),这是很多实验必备的条件。4小鼠基因序列与人同源性高,达91%。5具有其它TMEM16家族蛋白不具有的分子特性。6有其它氯离子通道研究作为基础。7潜在的钙激活氯通道的分子基础。有文献证明氯离子通道在急性肺损伤时对肺泡液体清除存在着一定作用,而且在前期预实验当中我们发现:TMEM16A在急性肺损伤过程中,其表达量会因疾病受到影响。因此我们选择复制了两种本实验室相对成熟的急性肺损伤大鼠模型:大肠杆菌(E.coli)气道注入和脂多糖(LPS)尾静脉注射模型,分别模拟肺内外源性急性肺损伤过程。比较两种肺损伤发病机制以及不同肺损伤模型中肺组织TMEM16A的组织含量表达差异。方法:选取清洁级健康雄性Sprague Dawley(SD)大鼠18只,体重250±10g,将其随机分为三组:正常对照组,LPS干预组,Ecoli干预组,各组均为6只。LPS组:经尾静脉注射LPS (8mg/kg),4小时后取材。E.coli组:大肠杆菌混悬液(3ml/kg)(浓度109级)气管内缓慢均匀滴入,24小时后取材。造模成功后将动物以10%水合氯醛(3ml/kg)腹腔注射麻醉,固定在手术台上。股动脉放血处死后立即开胸取新鲜肺组织(右肺下叶,于冰上操作),取材后立即放于已标记好的冻存管中,转移至-80℃冰箱中保存,留待蛋白印迹(Western blot,以下简称WB)用。取右肺上叶肺组织用于湿/干重比(W/D)检测。取右肺中叶肺组织用10%中性福尔马林溶液固定,留做病理及免疫组织化学检查。分离出气管,做“T”字型倒切口,行气管插管。用无菌生理盐水4ml行支气管肺泡灌洗术,使灌洗液在肺内停留20秒左右,期间反复摇晃手术台,使灌洗液尽可能渗透至肺泡腔内。如此反复3次,回收灌洗液,过滤后离心(1200rpm,10min)。上清液-80℃保存,留待蛋白含量测定。结果:1 WB结果正常组(1.599±0.142)及LPS组(1.652±0.036)之间无统计学差异(P>0.05),而大肠杆菌组(1.149±0.125)相比其它两组有明显下降(P<0.01)。2病理结果光镜下肺组织病理评分LPS组(11.33±1.37)与E.coli组(11.83±0.75)均明显高于正常组。两模型组之间无统计学差异(P>0.01)。3免疫组化可见肺血管平滑肌细胞及肺泡上皮细胞特异性染色。4肺泡灌洗液(bronchoalveloar lavage fluid, BALF)蛋白含量测定显示LPS组(1.15±0.12)与大肠杆菌组(0.91±0.29)均高于正常组(0.17±0.05)(P<0.01);肺湿干比显示两模型组LPS组(5.35±0.45)与大肠杆菌组(4.61±0.19)均明显高于正常组(3.79±0.42)(P<0.01)。结论:1本实验成功的复制了大肠杆菌及LPS诱导的肺内外源性急性肺损伤模型,此模型稳定性及预见性好,成功率高,易操作,是目前急性肺损伤研究较好的模型。也是本实验室成熟的实验模型。病理结果示造模成功。且两模型组之间病理损伤评分一致,可以做组间对比。2免疫组化证明在肺泡上皮细胞以及肺血管平滑肌细胞上存在我们所研究蛋白TMEM16A。3肺泡液蛋白渗出增加,肺湿干比重升高,说明肺泡液体清除率在急性肺损伤时是下降的,这一点在内源性急性肺损伤时与氯离子通道表达量的变化是一致的。4 TMEM16A在大肠杆菌所致急性肺损伤中表达明显降低。而LPS组则与正常组无统计学差异。说明不同原因所致急性肺损伤对于氯离子通道的影响是不一样的,应区别对待。反之,氯离子通道在不同诱因所致急性肺损伤过程中所起的作用可能也不一样,在今后的研究中应加强两组模型之间的比较。