【研究背景】创伤性脑损伤(traumatic brain injury,TBI)指机械性外力作用于头部发生的损伤,存在一个或者多个继发性病变,如颅骨骨折、创伤性颅内损伤、神经病学或者神经心理学改变、意识障碍或者死亡。当今社会,每年有超过1000多万人因TBI而入院或者死亡,其死亡率高达30%~50%,它是威胁人类生命的重要疾患之一。脑部结构复杂主要表现在各个部位的解剖结构和生理功能差异较大这两个方面,造成TBI的种类多种多样。弥漫性脑损伤(diffuse brain injury,DBI)是指机械性外力作用于头部引起颅腔内脑组织发生位移造成的损伤,是TBI的重要组成部分。近年交通事故伤和坠落伤的发生率明显提高,DBI已经成为严重威胁人类生命健康的重要损伤。法医学中与DBI相关的案件数量逐年增加,但因DBI及其并发症的复杂性,容易导致法医学鉴定错误地发生和案件的真相被掩盖。随着医学科学技术的进步和对DBI的深入性研究,相关的诊断设备及方法逐渐增多。目前法医学上多依据临床资料、解剖检验、普通组织病理学及免疫组织化学检测技术对DBI进行诊断、病情评估及损伤时间的推断。但是,大多数情况下DBI后颅脑神经影像学并没有特异性的表现;另一方面,实践中处理与DBI相关死亡的医疗纠纷案件常常受各方面因素影响导致尸检不能及时进行。尸体保存方法的不同和标本的固定不良等造成组织自溶,致使器官组织的形态学特征不典型而影响传统病理学观察和法医病理学家做出正确诊断。前期一系列研究已经表明,DBI可因直接打击、缺血缺氧等继发性损伤、炎性介质、细胞因子及氧自由基等机制诱发神经细胞死亡。因此,深入研究DBI后生物分子标志物的变化及其规律,对法医学鉴定及临床治疗都有重大意义。DBI生物分子标志物的筛选是法医学中的重点,已有研究表明DBI可激活内源性保护因子和损害因子,如脑红蛋白(neuroglobin,NGB)和β淀粉样蛋白(Amyloid-βprotein,Aβ)及与它们相关的自由基。NGB是一种主要表达于脊椎动物脑组织的球蛋白,主要功能是参与氧在中枢神经系统的储存与转运,脑损伤对神经元起着重要的保护作用。Aβ是β淀粉样前体蛋白(beta amyloid precursor protein,β-APP)经β分泌酶(beta-site amyloid precursor protein–cleaving enzyme 1,BACE1)和γ分泌酶分解产生的37~43个氨基酸残基组成的不同大小肽段,它主要通过氧化应激和钙超载两个方面机制损害神经元。目前研究表明,NGB不仅可以清除自由基以保护神经元免受损害,也可以削弱Aβ的毒性作用,从而对DBI后的神经元发挥保护作用。本课题研究利用改良的Marmarou模型复制DBI模型,观察DBI后脑干的病理变化,并检测NGB和Aβ表达量的变化。通过研究实验性大鼠DBI后脑干NGB和Aβ不同时间含量的变化规律,为法医学中DBI的诊断、损伤评估及损伤时间地推断提供重要的理论参考。【目的】研究实验性大鼠DBI后脑干Aβ和NGB不同时间点的表达水平及变化规律,初步探讨Aβ及NGB两者联合应用作为DBI后脑干生物分子标志物的可行性。【材料与方法】1.把成年健康的雌性Sprague Dawley(SD)大鼠随机分配为对照组和实验组两部分,其中实验组又分为1h、3h、6h、12h、24h、48h和72h组,每组大鼠10只。2.参照改良的Marmarou自由落体撞击方法复制DBI模型,先观察打击后大鼠的行为学变化,然后提取大鼠脑干组织,应用苏木精-伊红染色法、劳克坚牢蓝染色法及β-APP免疫组织化学染色方法确定大鼠DBI模型建立成功;利用Aβ和NGB的免疫组织化学技术观察其形态学及阳性表达变化;脑干中Aβ和NGB的表达量通过Western blotting进行检测,运用免疫荧光双标技术对Aβ和NGB表达的共定位情况进行观察。3.本实验研究中所有数据的统计学分析均用SPSS 18.0软件进行处理,Mean±SEM表示该研究中的数据,运用Office excel制作相关图表,组间比较采用单因素方差分析(one-way ANOVA),并且规定p<0.05具有统计学意义。【结果】1.各时间点损伤组大鼠脑干的病理改变均与DBI形态学特征相符,观察到神经轴索明显肿胀、呈串珠样改变,3h组即可检测到收缩球,伤后6h~72h,典型收缩球的范围及数量逐渐增加。2.免疫组化染色结果显示DBI脑干1h组NGB和Aβ的表达量均升高;3h和6h组NGB表达量降低,Aβ的表达量持续升高,并且Aβ在6h表达量升高至第一个峰值;12h~72h之间,NGB的表达量呈波动性变化,24h组Aβ的表达量出现第二个峰值。Aβ在1h、3h、6h、12h和72h这几个时间组的表达量均高于对照组,具有统计学意义;DBI1h、3h、12h、24h及48h组脑干NGB的表达量和对照组进行比较,均具有显著差异。3.Western blotting检测显示DBI1h组脑干NGB的含量明显升高至最大值,Aβ的含量也明显升高;3h组NGB的表达量出现显著回落,Aβ含量无明显变化;6h组NGB表达量继续降低,Aβ表达量明显升高,6h组表达量升高至第一个峰值;12h组NGB的表达量再次增加,Aβ出现降低;24h组NGB再一次出现降低,Aβ再次显著地增加至第二个峰值;48 h和72h组脑干NGB表达量变化不显著,Aβ表达量再次降低。4.β-APP和Aβ在脑干神经细胞胞浆及神经轴索定位基本一致;Aβ和NGB在脑干神经细胞胞浆定位一致,Aβ还特异性地表达于脑干组织细小血管周围,NGB特异性的在脑干神经细胞表达。【结论】脑干Aβ和NGB的变化规律作为DBI早期诊断的参考依据具有一定意义,尤其1h6h及24h这几个时间点可以看作DBI早期诊断和损伤时间推断的关键节点。