论文部分内容阅读
母禽繁殖性能取决于卵巢的发育水平,卵巢的主要功能作用则由卵泡体现,在性成熟启动后卵泡依次经过生长、募集、选择、等级卵泡发育并最终排卵。卵泡的主要结构由膜细胞（Thecacell,TC or T）、颗粒细胞（Granulosacell,GC or G）和卵母细胞构成。为了研究在卵泡发育过程转录组水平上的变化,本试验以京海黄鸡为研究对象,利用RNA-seq技术对卵泡发育过程中卵泡颗粒细胞和膜细胞的circRNA进行鉴定,并对circRNA和mRNA进行差异表达和功能分析,主要结果如下:研究一:取相同生理条件半同胞关系的母鸡卵泡颗粒细胞,利用RNA-seq技术分析小黄卵泡（Small yellow follicle,SYF）、F6 卵泡（The smallest hierarchical follicle,F6）和 F1 卵泡（The largest hierarchical follicle,F1）的颗粒细胞中 circRNA 和 mRNA 表达情况,进行各发育阶段的差异表达基因鉴定、基因功能富集分析等生物信息学方法,预测其可能参与的生物学过程。1、颗粒细胞中共鉴定出11,641个circRNA,有3,742个在各时期均有表达;各条染色体上均有分布,染色体长度越长分布越多;在基因组上的距离、侧翼内含子等特征表现出普遍规律;在序列长度、主要来源、外显子数量上表现出物种或组织特异性。2、卵泡颗粒细胞发育过程中差异表达circRNA与mRNA的数量不同,circRNA在各发育阶段差异表达数量在77-380个;mRNA仅在SYFG.vs.F6G和F6G.vs.F1G比较组合中有较多差异表达,数量为490-1,521之间;差异表达circRNA来源基因与差异表达mRNA有443个相同。即颗粒细胞发育过程中circRNA与mRNA可能表现了不同的调控模式。3、对差异表达转录本进行功能富集分析显示,差异表达circRNA来源基因参与了细胞生长、代谢、磷脂酰肌醇信号通路、MAPK信号通路等;差异表达mRNA参与了细胞周期、类固醇代谢、细胞黏附、卵母细胞减数分裂等繁殖相关通路。4、基于竞争性内源 RNA（Competing endogenous RNA,ceRNA）调控理论,构建 circRNA-miRNA调控网络,并筛选到靶向结合的gga-miR-15a,并预测其靶基因可能参与的生物过程,筛选到候选基因YWHAH。研究二:利用RNA-seq技术分析卵泡膜细胞在发育过程中circRNA和mRNA表达情况和生物信息学分析,试用鸡同研究一。1、膜细胞中共鉴定出14,503个circRNA,有5,622个在各时期均有表达;circRNA特征与颗粒细胞中circRNA相似。2、膜细胞发育过程中差异表达circRNA与mRNA数量不同,SYFT.vs.F6T、SYFT.vs.F1T和F6T.vs.F1T中差异表达circRNA数量分别为5、75和48个,差异表达mRNA数量分别为672、1,214和2个。差异表达circRNA的来源基因与差异表达mRNA无交集。差异表达mRNA在SYFT中表达量和表达水平均高于F6T和F1T时期,而差异表达circRNA的表达水平范围接近。3、对差异表达转录本进行功能富集分析显示,卵泡膜细胞中差异表达circRNA参与了信号传导、脂质定位、繁殖和炎症反应等过程;差异表达mRNA主要参与了细胞周期、细胞生长、细胞外基质受体作用、卵母细胞减数分裂等繁殖相关过程。研究三:高通量测序和差异表达结果发现热点基因（hot-spot gene）RalGPS2共产生20个circRNA异构体,其中在卵泡颗粒细胞发育过程中差异表达3个（novelcirc0027214、novelcirc0027217、novelcirc0027220）,在卵泡膜发育过程差异表达 2 个（novelcirc0027214、novelcirc0027217）,将上述所有 circRNA 命名为 circRalGPS2s。对其序列进行分析发现其中exon2、exon8、exon9作为公共区域参与形成了上述circRalGPS2。基于此,对circRalGPS2进行外显子多态性分析、表达谱分析、功能预测分析和作用机制的初步探讨,结果如下:1、利用PCR-SSCP技术检测circRalGPS2的exon2、exon8、exon9的多态性,发现均无突变位点,说明无SNP突变的circRNA更容易充当miRNA的sponge发挥作用。2、利用荧光定量技术检测circRalGPS2的各繁殖器官中的表达水平,发现三种circRalGPS2在各卵巢组织中表达规律相似,均以在卵巢皮质部中的表达水平最高,卵泡发育水平越高表达水平越低。3、对circRalGPS2构建circRNA-miRNA调控网络和靶基因预测,共预测到潜在靶基因538个,生物信息学表明circRa1GPS2可能参与了蛋白质修饰、信号调控、酶活性、卵母细胞减数分裂、肌动蛋白细胞骨架的调控和ErbB信号通路等生物过程中,潜在的靶基因可能有 ADCY3、PLCB1、CAMK2G、PIK3R1 等。4、对circRalGPS2候选靶结合基因gga-miR-200a-3p进行靶标验证,结果显示circRalGPS2与gga-miR-200a-3p有结合但不显著,可能circRalGPS2通过间接作用影响gga-miR-200a-3p或是通过其他的circRNA作用机制发挥对卵泡发育的调控作用。研究四:卵泡发育是由颗粒细胞、膜细胞共同协调完成,本节则对颗粒细胞和膜细胞中circRNA和mRNA进行差异表达分析,并利用表达水平为方差前25%的转录本进行权重基因共表达网络分析（Weighted geneco-expression network analysis,WGCNA）分析,结果如下:1、在卵泡颗粒细胞和膜细胞中广泛表达的circRNA为8,127个,分别有3,514个和6,375个在两种细胞上差异表达,在两种细胞鉴定到的circRNA分布规律和特征相似;卵泡颗粒细胞和膜细胞中共检测23,769个mRNA在两种细胞中均表达,特异表达的数量分别为587和1,425个;颗粒细胞和膜细胞中circRNA的GC（鸟嘌呤胞嘧啶,Guanine cytosine）含量均高于60%,且膜细胞中circRNA和mRNA的GC含量均高于颗粒细胞。2、circRNA和mRNA在不同发育时期卵泡膜和颗粒细胞中差异表达数目具有较大差异,circRNA在同一发育时期的颗粒细胞和膜细胞中差异表达数量均较多,mRNA仅在SYF阶段有较多差异表达;颗粒细胞和膜细胞中上调表达的circRNA多来自于编码基因,有207个circRNA在各阶段均差异表达,novelcirc0002934来源于基因RAB11A为颗粒细胞和膜细胞中均高表达circRNA;SYF阶段差异表达mRNA有基因KCNQ1、PRL4、IL7R等。在SYF阶段差异表达circRNA的来源基因与差异表达mRNA有9个相同,包括基因ESR1、MINDY4、INPPA4 等。3、差异表达转录本GO分析显示,SYF和F1中差异表达circRNA注释到的GO条目大部分相同,主要在细胞过程、细胞分化、细胞代谢等过程;F6阶段差异表达circRNA主要在物质反应、生物黏附等过程;KEGG分析结果发现差异表达circRNA在FoxO信号通路、GnRH信号通路、ECM-信号通路、孕酮介导的卵母细胞成熟等通路中有富集;差异表达mRNA在细胞黏附、FoxO信号通路、PPAR信号通路、调亡等过程中均有参与。4、以卵泡颗粒细胞和膜细胞中表达水平方差前25%的转录本进行WGCNA分析,共鉴定到18个模块,经分析筛选到6个特异表达模块与卵泡颗粒细胞和膜细胞发育阶段密切相关;特异模块中基因的GO和KEGG分析表明,不同的特异表达模块基因参与了不同发育时期或细胞的增殖、分化、凋亡等生物过程,包括基因ORC5、PIK3CA、PAK1、SOD1、ITGB1、CDC26、PAK2、MCM6等;根据hub基因的网络图鉴定到一系列与卵泡发育密切相关的基因,包括 MAPK1、GDF9、STAR、DST、SOD2、PSMC1、MDH1、ACTC1、novelcirc0004730等。上述基因可能参与了卵泡发育过程中的增殖、分化和凋亡等生物过程。