脾虚证本质的研究是中医现代化研究的重要内容之一。随着研究的深入,人们发现脾虚证的致病机理涉及消化系统、免疫系统、内分泌系统、神经系统、血液系统、肠道菌群和能量代谢等多个方面。近年来,系统生物学的方法开始应用于脾虚证本质研究,但尚处于初步阶段。目前已有学者分别使用iTRAQ技术、16S rDNA测序技术和基因芯片技术对脾虚证的蛋白组学、微生物组学和转录组学进行了探索,但是,应用RNA-seq或Small RNA-seq技术进行脾虚证研究的相关报道较少。本论文共分为两部分。由于气虚体质是脾虚证的前驱状态,研究健康人气虚体质的生物学机制将有助于理解脾虚证的早期发生状态。论文的第一部分研究了健康人气虚体质相关差异表达lncRNA、miRNA和mRNA并构建了 ceRNA网络调控。论文第二部分研究了慢性胃炎脾虚证相关差异表达lncRNA、miRNA和mRNA并构建了 ceRNA网络调控,从病证结合的角度,研究脾虚证的病理机制。目的:在本次研究中我们以健康人气虚体质、慢性浅表性胃炎(Chronic Superficial Gastritis,CSG)脾虚证和慢性萎缩性胃炎(Chronic Atrophic Gastritis,CAG)脾虚证人群为研究对象,应用最前沿的RNA-seq技术和ceRNA理论,从转录组学水平上进行了脾虚证内在生物学机制的研究。综合两部分的研究结果,我们试图从体质、证候、疾病的自然进展方向,研究健康人气虚体质、CSG脾虚证和CAG脾虚证内在转录调控机制的相互关联,找到“气虚体质—脾虚证”相关的生物标志物或标志网络,以期阐释脾虚证的生物学基础。本研究也有助于预测疾病的发生与发展,从而为明确脾虚证自身特点及与其他因素(如体质、证候、疾病等)的关系提供了可能。方法:2016年6月～2018年12月期间,在北京中医药大学附属东方医院通过广告或电话进行健康受试者招募,包括健康人平和体质、气虚体质和湿热体质。同期进行慢性胃炎患者招募,包括慢性浅表性胃炎(脾虚证、湿热证),慢性萎缩性胃炎(脾虚证、湿热证)患者。采集临床研究受试者外周血,分离白细胞后提取总RNA,分别进行RNA-seq和Small RNA-seq分析。获得的测序数据用生物信息学方法进行分析,筛选出差异表达的mRNA、lncRNA和miRNA,对差异表达基因进行生物功能与信号通路富集分析。对差异表达的mRNA、lncRNA和miRNA进行ceRNA网络构建,获得脾虚证相关的ceRNA调控网络关系。本研究经北京中医药大学东方医院临床研究伦理委员会审查,伦理审批号:JDF-IRB-2016031002临床研究注册号:NCT02915393。结果:第一部分:1、在本研究中,我们总共纳入病例25例,分别为健康人平和体质13例、气虚体质7例、湿热体质5例。随机选择了健康人平和体质5例、气虚体质5例、湿热体质4例的外周血白细胞样本的总RNA进行了 RNA-seq和Small RNA-seq分析。2、通过对测序数据的生物信息学分析,我们获得了健康人气虚体质相关的差异表达mRNA60个、lncRNA76个、miRNA42个。功能分析发现,细胞质膜组成成分和细胞质膜在差异表达mRNA和miRNA的GO富集中出现。蛋白丝氨酸/苏氨酸激酶活性在差异表达lncRNA和miRNA的GO富集中出现。在对健康人气虚体质相关差异基因的通路分析中发现,赖氨酸降解在差异表达lncRNA和miRNA的KEGG富集中出现。3、通过对健康人气虚体质的差异表达miRNA、mRNA和lncRNA进行ceRNA分析,共获得3182个miRNA-lncRNA对,955个miRNA-mRNA对,最终筛选到9514对ceRNA。这些ceRNA调控网络涉及了 36个GO功能和31个KEGG信号通路。4、从健康人气虚体质差异表达的mRNA中筛选出99个免疫相关的基因,涉及了11个GO功能和8个KEGG信号通路。第二部分:1、在本研究中,我们总共纳入病例70例,分别为CSG脾虚证28例、湿热证21例;CAG脾虚证7例、湿热证14例。随机选择了CSG脾虚证6例、CSG湿热证5例、CAG脾虚证5例,CAG湿热证5例的外周血白细胞样本的总RNA进行了 RNA-seq和Small RNA-seq建库和测序。2、通过对测序数据的生物信息学分析,我们获得了CSG脾虚证患者相关的差异表达mRNA7个、lncRNA 103个、miRNA4个。在对CSG脾虚证相关的差异基因的功能分析中发现,细胞质膜在差异表达mRNA和miRNA的GO分析中均显著富集。在对CSG脾虚证相关的差异基因的功能分析中发现,胰岛素分泌以及胰岛素信号通路分别在差异表达mRNA和miRNA的KEGG分析中显著富集。通过对CSG脾虚证的差异表达 miRNA、mRNA 和 lncRNA 进行 ceRNA 分析,共获得 433 个 miRNA-lncRNA 对,226个miRNA-mRNA对,最终筛选到548对ceRNA。这些ceRNA调控网络涉及了10个GO功能和11个KEGG信号通路。从CSG脾虚证差异表达的mRNA中筛选出89个免疫相关的基因,涉及了 66个GO功能和15个KEGG信号通路。3、我们获得了 CAG脾虚证患者相关的差异表达mRNA 20个、lncRNA 79个、miRNA 29个。在对CAG脾虚证相关的差异基因的功能分析中发现,细胞质膜和细胞质膜的组成成分在差异表达mRNA和miRNA的GO分析中均显著富集。通过对CAG脾虚证的差异表达miRNA、mRNA和lncRNA进行ceRNA分析,共获得1028个miRNA-lncRNA对,1123个miRNA-mRNA对,最终筛选到3625对ceRNA。这些ceRNA调控网络涉及了 59个GO功能和34个KEGG信号通路。从CAG脾虚证差异表达的mRNA中筛选出139个免疫相关的基因,涉及了 20个GO功能和28个KEGG信号通路。4、从上述测序结果中进一步挖掘,获得脾虚证相关的差异表达mRNA 570个、lncRNA2009个、miRNA 303个,这些差异基因涉及了 9个GO功能和4个KEGG信号通路。通过对CAG脾虚证的差异表达miRNA、mRNA和lncRNA进行ceRNA分析,共获得6个miRNA-lncRNA对,9个miRNA-mRNA对,最终筛选到4对ceRNA,其中的关键基因CD300H的mRNA水平在气虚体质和脾虚证中显著降低(P=0.03)。从CAG脾虚证差异表达的mRNA中筛选出84个免疫相关的基因,涉及了 9个GO功能和18个KEGG信号通路。结论:健康人气虚体质与慢性胃炎脾虚证存在特异的转录组表达谱,且气虚体质与脾虚证的差异基因表达谱具有一定的相似性,尤其体现在免疫相关的基因表达方面。功能分析提示“气虚体质—脾虚证”涉及多种免疫相关功能异常,此外在激素分泌、细胞质膜、信号转导、物质代谢等多种生命活动中存在差异。转录组学的联合分析揭示了CD300H基因的ceRNA参与“气虚体质—脾虚证”相关的转录调控网络。本研究的结果为挖掘脾虚证潜在的生物学基础提供了重要参考。