宫颈癌是女性常见肿瘤。大量研究证实，高危型人乳头瘤病毒（HPV）持续感染与宫颈癌及其癌前病变关系非常密切。截止目前，已发现有近30种高危型HPV和超过70种低危型HPV。高危型HPV按照流行程度由高到低依次为HPV16、18、45、31、33、58、52、35、59、56、6、51、68、39、82、73、66和70型。不同类型的HPV致癌作用差别很大，HPV16型为迄今为止发现的最常见的高危亚型，约占宫颈癌患者总数的50%。高危型HPV（HR-HPV）的基因编码的三种早期蛋白（E5、E6、E7），具有促进细胞生长和转化的作用。E6蛋白与p53结合后阻碍细胞凋亡导致细胞永生化，在肿瘤的发生过程中起到重要作用。为此，我们选择最常见的HPV16型E6作为研究的切入点，并设想，既然HPVE6、E7的致癌机制中均与细胞永生化相关，而目前已发现与细胞寿命和永生化关系最为密切的是端粒和端粒酶(telomerase)，因此，在宫颈癌发生过程中，HPV16E6与端粒酶之间可能存在着某种关系和相互作用，直接或间接地影响和调控着HPV的致癌和细胞的恶性转化及永生化能力。端粒酶是一种细胞RNA依赖的DNA聚合酶，能够维持细胞染色体末端端粒长度。人端粒RNA亚单位(human telomeraseRNA, hTR)和人催化亚基端粒酶逆转录酶（Human telomerase reversetranscriptase，hTERT）共同组成人端粒酶的催化中心。hTERT仅在端粒酶阳性细胞中有所表达，是端粒酶的限速成分。有报道，hTERT在外阴上皮内瘤变及外阴癌、口腔癌及其癌前病变、食管癌、肺癌、直肠癌、肝癌等组织中呈过度表达，但关于宫颈癌前病变及宫颈癌组织中HPVE6蛋白和hTERT蛋白的表达有何关联，它们在宫颈癌发生、发展过程中的作用机制以及它们与一些相关临床病理特征之间是否存在相关性的研究甚少。本课题从几个不同层面探讨了HPV16E6和hTERT在宫颈癌致癌过程中的相互关系和分子机制：首先探讨HPV亚型在广西地区宫颈病变组织中的分布特点；然后，利用免疫组化技术从蛋白水平对HPV16E6和hTERT蛋白表达水平进行定位和半定量检测，从mRNA水平分析HR-HPVE6/E7mRNA在宫颈病变中的表达规律；最后通过RNA干扰（RNA interference,RNAi）技术，利用宫颈癌Caski细胞系具有持续表达HPV16、hTERTmRNA的特点，通过体外试验将HPV16E6-shRNA、hTERT-shRNA分别转导入该细胞，并观察其细胞生物学行为改变，以探讨HPV16E6、hTERT小干扰RNA (smallinterfering RNA, siRNA)能否抑制宫颈癌细胞的生长，以验证HPV16E6与hTERT在致癌过程中的作用及互相影响，为深入探讨宫颈癌发生发展的分子机制提供新的特异性基因治疗靶点和技术，也为宫颈癌的基因治疗应用于临床奠定实验基础。研究内容包括以下三部分：第一部分宫颈病变中HPV亚型的分布特点目的：了解广西地区宫颈炎、CIN和宫颈癌中HPV感染情况和亚型分布规律。方法：收集选取病理科2009-2013年存档宫颈病变，包括宫颈炎、宫颈上皮内瘤变（cervical intraepithelial neoplasia，CIN）Ⅰ～Ⅲ级、宫颈鳞癌（SCC，squamous cell carcinoma）、宫颈腺癌（ADC, adenocarcinoma）石蜡包埋组织236例，其中包括宫颈炎症41例、CINⅠ级45例、CINⅡ级42例、CINⅢ级41例、SCC39例、ADC28例。对236例标本石蜡切片后分别进行HE染色、PCR-反向点杂交法对23种HPV亚型（包括18种高危型，5种低危型）分型检测。结果：1.宫颈病变与HPV阳性率关系236例宫颈病变组织中，HPV阳性率65.68%（155/236）。宫颈炎、CINⅠ（cervical intraepithelial neoplasia，CIN）、CINⅡ、CINⅢ、SCC、ADC组HPV阳性率分别为24.39%（10/41）、46.67%（21/45）、59.52%（25/42）、95.12%（39/41）、97.44%（38/39）、78.57%（22/28）。HPV阳性率随宫颈病变程度加重而升高（P＜0.05）。2. HPV亚型分布规律共检出18种HPV亚型（包括4种低危型和14种高危型）。HPV亚型检出率由高到低排列依次为：高危型HPV16，32.20%（76/236）；HPV18，12.29%(29/236)；HPV58，8.47%(20/236)，HPV52，5.93%(14/236)，HPV33，5.08%(12/236)；HPV45，5.08%(12/236)。低危型HPV11，2.54%（6/236）和HPV6，1.70%（4/236）。其中，HPV16感染率最高，占所有HPV阳性例数的49.03%（76/155）。3. HPV单一感染及多重感染规律单一感染占所有阳性病例的74.19%（115/155）；双/多重感染占25.81%（40/155），包括40例高危型HPV双/多重感染（其中以HPV16，18双重感染最常见11/40）；三重感染25/155（16.12%）；四重感染3/155（1.94%）。结论：1.宫颈病变的发生与HPV感染紧密相关，HPV阳性率随宫颈病变程度加重而升高，高危型多重感染常见于高级别CIN和宫颈癌，宫颈鳞状细胞癌的HPV阳性率最高；2.广西地区前五种最常见的高危亚型分别为：HPV16、18、58、52、33，HPV16位居第一，与宫颈鳞癌密切相关，而宫颈腺癌与HPV18关系尤为密切。第二部分宫颈病变组织中HPV16E6及hTERT表达及其与临床病理特征的关系目的：探讨HPV16E6及hTERT在宫颈病变组织中的表达，并分析其与临床病理特征和HPV亚型的关系。方法：收集标本同上。采用免疫组化SP法检测不同程度宫颈病变组织中HPV16E6（n=179）和hTERT（n=236）蛋白表达；bDNA法进行E6/E7mRNA表达水平的半定量检测（n=236）。并分析其与患者临床病理特征、HPV亚型的关系。结果：1.HPV16E6和hTERT蛋白在宫颈病变组织中的表达在宫颈炎、CINⅠ、CINⅡ、CINⅢ、SCC、ADC组中HPV16E6蛋白阳性表达率分别为0.00%（0/34）、0%（0/35）、4.35%（1/23）、12.00%（3/25）、35.90%（14/39）、52.17%（12/23）；hTERT表达阳性率分别为0.00%（0/41）、2.22%（1/45）、7.14%（3/42）、39.02%（16/41）、92.31%（36/39）、92.86%（26/28），两者表达强度均随病变程度进展而递增，各组阳性率存在显著差异（P＜0.0005），以宫颈癌（SCC、ADC）组织中表达阳性率最高。2. E6与hTERT蛋白表达与临床病理特征的关系HPV16E6蛋白的表达与高危型HPV感染呈正相关（P=0.029），hTERT蛋白的表达与高危型HPV感染（P=0.041）、宫颈肿瘤家族史（P=0.034）呈正相关（P＜0.05），与其他临床病理特征无显著关系（P＞0.05）。3. E6与hTERT蛋白表达的相关性E6蛋白与hTERT蛋白表达阳性率的呈正相关，且相关显著（P＜0.05）。4. HR-HPV E6/E7mRNA在宫颈病变组织中的表达57.8%（126/218）的病例可检测出HR-HPVE6/E7mRNA表达，其表达水平随宫颈病变程度加重而升高（P＜0.05），在≥CINⅡ的病变中，92.74%（115/124）的病例可检测到E6/E7mRNA的表达，而＜CINⅡ的病变中仅有35.48%（11/31）； E6/E7mRNA的表达在多重感染病例中较单一感染病例更显著（60.32%VS.39.68%，P＜0.05）。5. HPV亚型与HPVE6/E7mRNA表达水平的关系HPV45阳性病例中E6/E7mRNA表达率最高（91.7%），其次为HPV16（71.9%）、18（69.8%）、31（65.2%）、52（56.0%）。在HPV16阳性的＜CINⅡ及≥CINⅡ病例中E6/E7mRNA的表达率分别为81.2%、50.0%，差别有统计学意义（P＜0.05）。结论HPV16E6、hTERT蛋白及HR-HPV E6/E7mRNA表达与宫颈病变密切相关，且与宫颈病变程度呈正相关。HPV多重感染，尤其HPV45亚型感染的E6/E7mRNA表达明显升高。第三部分RNA沉默HPV16E6、hTERT基因对宫颈癌Caski细胞生物学行为的影响目的：探讨HPV16E6、hTERT基因沉默对宫颈癌Caski细胞生物学行为的影响。方法：分别构建HPV16E6shRNA和hTERT-shRNA慢病毒表达载体并转染人宫颈癌Caski细胞；用荧光定量PCR、Western blot方法测定空白组（B）、阴性对照组（LV3-shRNA-NC）和干扰组（LV3-shRNA）中HPV16E6、hTERTmRNA和蛋白表达水平；细胞划痕实验检测细胞迁移能力；CCK8细胞增殖实验检测细胞增殖情况；Transwell实验检测细胞体外侵袭能力；流式细胞技术测定细胞周期及凋亡。结果：1．HPV16E6-shRNA、hTERT-shRNA慢病毒表达载体构建重组HPV16E6-shRNA、hTERTshRNA质粒的阳性克隆经PCR鉴定、测序分析，结果显示，慢病毒重组质粒中分别针对HPV16E6、hTERT基因的4对shRNA链成功与质粒pGLV3/H1/GFP+Puro连接，成功构建了HPV16E6、hTERT的shRNA慢病毒表达载体。2.病毒包装和滴度测定经包装、纯化、浓缩后产生的慢病毒滴度为1×108TU/ml，病毒包装成功，可以进行下游慢病毒介导的RNA干扰实验。3.有效干扰序列筛选HPV16E6-shRNA：转染后各组E6mRNA抑制率14%～72%，以96H-E6-19组E6mRNA表达下降最为明显，抑制率最高（72%）；WB结果显示，96H-E6-19组E6蛋白灰度值为0.433±0.032，下降57.7%，明显低于空白对照组和阴性对照组(P＜0.05)。由于96H-E6-19干扰效果最明显，将其选取作为有效干扰序列进行下游实验。hTERT-shRNA：转染后各组hTERTmRNA抑制率58%～75%，以72H-TERT-1515组hTERTmRNA表达量下降最明显，抑制率最高（75%）；WB结果显示，72H-TERT-1515组hTERT蛋白灰度值为0.293±0.068，下降70.7%，均明显低于空白对照组和阴性对照组(P＜0.05)，由于72H-TERT-1515干扰效果最明显，将其选取作为有效干扰序列进行下游实验。4.HPV16E6与hTERT的相互影响E6沉默后，hTERTmRNA表达水平受到明显抑制(P＜0.05)，抑制率最高达70%；而hTERT沉默后，E6mRNA表达水平下降不明显(P＞0.05)。5. HPV16E6-shRNA、hTERT-shRNA对宫颈癌Caski细胞生物学行为的影响细胞划痕试验结果显示空白对照组、阴性对照组、E6-19组、TERT-1515组48h愈合率均值分别为0.927±0.01、0.783±0.07、0.637±0.04、0.58±0.11，E6-19组、TERT-1515组与空白对照组比较，愈合率明显下降（P＜0.05）；cck8细胞增殖实验结果显示相对于空白对照组细胞，E6-19组、TERT-1515组细胞增殖减慢（P＜0.05）；Transwell细胞体外侵袭实验结果显示转染了HPV16E6-19-shRNA和hTERT-1515-shRNA的Caski细胞穿膜数量较空白对照组、阴性对照组明显减少（P＜0.05）；流式细胞仪检测细胞周期发现，转染前空白对照组的G0-G1期比率是61.32%，转染后，E6-19组和hTERT-1515组G0-G1期比率则分别为85.27%、83.51%，细胞增殖指数分别为14.73%和16.49%，与空白对照组（38.68%）相比， G0/G1期细胞增多，增殖指数减少（P＜0.05）；细胞凋亡实验发现，空白对照组、阴性对照组、E6-19组和hTERT-1515组凋亡率分别为1.13±0.18%、1.26±0.22%、4.15±0.13%、4.79±0.25%，E6-19组和hTERT-1515组凋亡率明显高于空白对照组（P＜0.05）。结论：1. HPV16E6-shRNA、hTERT-shRNA在体外参与人宫颈癌Caski细胞的生物学行为调控：沉默HPV16E6/hTERT基因可抑制人宫颈癌Caski细胞的生长，诱导癌细胞凋亡，减弱其迁移和侵袭能力。2. HPV16E6与hTERT在宫颈癌发生、发展过程中互相作用，起促癌作用。