论文部分内容阅读
为了明确PTHrP NLS和C末端缺失引起的脑发育障碍是否与神经干细胞自我更新能力降低有关,我们通过原代和传代培养3天龄PTHrP KI (PTHrPNLS和C末端缺失)和WT小鼠海马区来源的神经干细胞,利用神经球计数、BrdU掺入、流式细胞仪分析和Western blot的方法比较分析了PTHrP KI和WT小鼠神经干细胞的表型变化。结果显示：原代和传代神经球形成效率及传代／原代神经球比例在PTHrP KI小鼠较WT小鼠明显降低；神经干细胞增殖在PTHrP KI小鼠较WT小鼠明显降低,而神经干细胞凋亡在PTHrP KI小鼠较WT小鼠明显增加；CDK2和CDK4表达水平在PTHrP KI神经干细胞中显著下调；而p16、p21和p27以及Caspase-3在PTHrP KI神经干细胞中显著上调。这些结果说明：PTHrP NLS和C末端能够通过激活细胞周期依赖性激酶CDK2和CDK4,抑制p16、p21、p27,促进神经干细胞增殖,抑制凋亡,而发挥维持神经干细胞自我更新能力的作用。为了明确甲状旁腺素相关肽PTHrP NLS和C末端缺失对脊髓发育的影响,我们利用组织学、免疫组织化学和分子生物学等方法,比较分析了1周或2周龄PTHrP KI和同窝WT小鼠脊髓的表型差异。结果显示：PTHrP KI小鼠脊髓长度变短,重量减轻,颈段和腰段脊髓横切面截面积变小。NeuN阳性细胞百分率在PTHrP KI小鼠脊髓中明显减少；MBP阳性少突胶质细胞面积和髓鞘形成数目在PTHrP KI小鼠脊髓中明显减少。PCNA阳性神经细胞百分率在PTHrP KI小鼠明显减少；Cyclin D1、CDK4和CDK6mRNA表达水平和Cyclin D1、Cyclin E、CDK2、CDK4、CDK6蛋白表达水平在PTHrP KI小鼠脊髓中明显下调,而p16、p19、p21和p27基因和蛋白表达水平在PTHrP KI小鼠脊髓中均明显上调；这些结果说明：PTHrP NLS和C末端能够通过促进脊髓神经干细胞增殖,诱导其向神经元和少突胶质细胞分化,加速髓鞘形成,而发挥促进脊髓发育的作用。为了研究p27是否作为PTHrP NLS的下游靶标之一参与了PTHrP NLS对脑发育的调节,我们建立了p27-/-KI小鼠模型,运用组织化学、免疫组织化学和Western Blot等方法,比较分析了2周龄p27-/-KI小鼠与同窝p27-/-、PTHrPKI及WT小鼠脑的表型差异。结果显示：p27基因敲除能够延长PTHrP KI小鼠生存期,并改善其生长发育；增加PTHrP KI小鼠脑重,改善其脑形态发生异常；上调CyclinD1,下调p19和p53,促进PTHrP KI小鼠脑各部神经细胞增殖；促进PTHrP KI小鼠脑各部的神经元分化,改善小脑外颗粒层神经细胞的迁移和成熟；增加PTHrP KI小鼠脑各部GFAP阳性星形胶质细胞和MBP阳性少突胶质细胞面积。Shh通路相关分子Shh、Smo、Gli1/2和Bmi-1表达水平在p27-/-小鼠脑组织中明显上调；在PTHrP KI小鼠中明显下调,而敲除p27能够上调这些分子在PTHrP KI小鼠脑组织中的表达。这些结果说明：p27能够通过激活Shh通路,促进神经干细胞增殖,诱导其向神经元和胶质细胞分化,而发挥改善PTHrP NLS和C末端缺失引起的脑发育障碍。本研究结果不仅进一步阐述了PTHrP NLS和C末端在调控中枢神经系统发育中的作用机制,也为将PTHrP NLS和C末端应用于促进神经再生的临床研究提供实验和理论依据。