论文部分内容阅读
捻转血矛线虫是一种重要的牛羊寄生虫,广泛存在于全球各大牧区,多寄生于幼龄小反刍动物的皱胃,引起牛羊幼畜的极度消瘦,感染高峰期可给牧区养殖业造成巨大的经济损失。目前,该病的防治主要通过驱虫药,但随着越来越多的抗生素被用于该病的防治,捻转血矛线虫耐药虫株也随之出现,为该病的防治的提出了新的挑战。相关研究指出,大剂量紫外辐照可有效地降低捻转血矛线虫幼虫的发育率和成虫产卵率,接种经高剂量紫外辐照处理过的感染性幼虫可诱导宿主产生高水平的保护性免疫效果,而接种正常幼虫的羊宿主中则没有观察到该效果。本实验室研究显示,适当强度的紫外辐照可使捻转血矛线虫的应激分子如钙网织蛋白（CRT）和热休克蛋白70（HSP70）在虫体细胞表面高表达,这可能在诱导宿主高保护性免疫应答中起到了关键性作用。因此,本实验比较研究了不同辐照剂量对捻转血矛线虫L3期幼虫的致弱效应;初步对辐照致弱捻转血矛线虫L3期幼虫诱导宿主高保护免疫效果进行评估;初步对辐照致弱捻转血矛线虫幼虫外分泌蛋白（ESP）及重组虫体蛋白（Hc CRT、Hc HSP70）诱导羊免疫细胞免疫应答反应进行探究。旨在进一步阐明辐照致弱捻转血矛线虫L3期幼虫引起宿主高保护性免疫应答的细胞与分子机制。首先,我们分析了不同辐照剂量对捻转血矛线虫L3期幼虫的致弱效应。不同组幼虫分别辐照（0～10 min）,体外分别培养（0～16d）进行光镜观察。发现辐照时间为0 min和3 min的幼虫存活率存在显著差异,且存活率均高于60%;使用经3 min辐照和正常幼虫分别免疫接种绵羊宿主,在免疫后（18～22d）进行虫卵计数,22d剖检进行成虫计数。结果发现辐照组与正常组相比粪检虫卵数量显著减少,幼虫发育率下降99%以上,表明3 min紫外辐照对捻转血矛线虫L3期幼虫具有显著的致弱效应。其次,我们验证辐照捻转血矛线虫L3期幼虫是否能够诱导宿主产生高保护性免疫。我们对初次免疫后25d的动物进行攻击感染,在攻击感染后23d,计算减卵率;攻击感染后26d,同期剖检各组绵羊,计算皱胃减虫率。同时分离初次免疫后（2d,7d,13d,18d）和攻击感染后（2d,5d,13d）的各组绵羊血清进行抗体水平检测。发现在攻击感染后,辐照组减卵率达75%,减虫率达97%;初次免疫后,免疫早期各组特异性抗体Ig G和分型抗体Ig G1、Ig G2、Ig A、Ig M均上调,辐照组抗体总含量显著高于正常组。攻击感染后辐照组血清内寄生虫特异性抗体Ig G和各分型抗体含量均呈现继续上调的趋势;表明辐照致弱捻转血矛线虫L3期幼虫能够引起宿主更高的体液免疫反应。此外,我们采用Transwell法初步研究了辐照和正常捻转血矛线虫L3期幼虫ESP的免疫功能,收取初次免疫以及攻击感染后的羊宿主外周血单个核细胞（PBMC）分别与正常幼虫共培养24h,采用ELISA法检测PBMC细胞因子的表达量。结果发现:辐照组和正常组虫体与阴性PBMC共孵育,都能使宿主PBMC细胞上调表达TH2型IL-4、IL-13;TH1型IFN-γ、TNF-α和IL-17等细胞因子,但辐照组细胞因子TH2型细胞因子IL-4、IL-13表达水平高于正常组,正常组细胞因子TNF-α、IL-17表达水平高于辐照组;经辐照和正常虫体免疫后的绵羊,取PBMC与正常组幼虫共孵育,各组TH1/TH2型细胞因子IL-4、IL-10、IL-13、IFN-γ、TNF-α和调节性因子IL-17均上调。辐照组可诱导宿主产生趋向于TH2型免疫的TH1/TH2混合免疫应答,而正常组诱导宿主产生趋向于TH1型免疫的TH1/TH2混合免疫应答。与此同时,我们初步研究了应激蛋白（Hc CRT、Hc HSP70）诱导羊免疫细胞免疫应答反应的机制,分别取初次免疫和攻击感染后不同时间段各组PBMC和剖检的各组肠系膜淋巴结细胞进行刺激。发现线虫重组蛋白Hc CRT能使绵羊阴性PBMC细胞上调表达TNF-α、IFN-γ、IL-4、IL-10等细胞因子,使阴性淋巴细胞下调表达TNF-α、IFN-γ、IL-4、IL-10等细胞因子,使初次免疫和攻击感染后各组PBMC/淋巴结细胞下调表达IL-4、IL-13、TNF-α、IL-10、IL-17等细胞因子;线虫重组蛋白Hc HSP70能使绵羊PBMC/淋巴细胞上调表达TNF-α、IFN-γ、IL-4、IL-10等,表现出类似于辐照虫体刺激的混合型免疫应答反应。总之,本研究发现适当剂量紫外辐照可在保证幼虫存活率的同时,抑制捻转血矛线虫L3期幼虫发育率;还发现辐照致弱捻转血矛线虫L3期幼虫可诱导宿主产生高保护性体液免疫和细胞免疫效果,辐照致弱捻转血矛线虫L3期幼虫外分泌蛋白（ESP）及候选应激蛋白Hc HSP70可诱导羊免疫细胞产生趋向于TH2型细胞免疫应答的TH1/TH2混合型免疫反应。本研究对证实辐照苗免疫效果以及阐明其中分子与细胞机制提供实验依据。