论文部分内容阅读
磷脂酶C(phospholipase C,PLC,EC3.1.4.3)能够水解甘油磷脂,生成甘油二酯、磷酸胆碱、磷酸肌醇以及磷酸乙醇胺。随着工业发展需求的提高,以及对磷脂酶C功能的进一步了解,其应用范围已经从最初的医药领域逐步扩展到油脂加工、食品加工、日化等领域。但是目前国内外所研究的磷脂酶C,其来源以及其表达宿主在医药和食品领域的应用大都存在安全隐患。蜡样芽胞杆菌(Bacillus cereus,B.cereus)磷脂酶C,没有相关报道其与B.cereus的致病性有联系,也没有蜡样芽孢杆菌磷脂酶C(B.cereus/PLC)作为致病因子的相关报道。因此,本研究通过选取蜡样芽孢杆菌磷脂酶C作为研究对象,分别以大肠杆菌BL21/DE3(Escherichia coli,E.coli)、乳酸克鲁维酵母GG799(Kluyveromyces lactis,K.lactis)和枯草芽胞杆菌WB600(Bacillus subtilis,B.subtilis)作为表达宿主,构建重组表达载体pET28abcplc1、pKLAC1bcplc2、pHY300bcplc3,然后将重组表达载体分别转入E.coli,K.lactis和B.subtilis,成功得到以下重组菌株:重组DE3/pET28abcplc1,K.lactis/pKLAC1bcplc2和B.subtilis/pHY300bcplc3。对重组酶进行提取纯化后,对其酶学性质进行了研究。主要结论如下:(1)重组大肠杆菌磷脂酶C(DE3/PLC)经SDS-PAGE分析在30 kDa附近有明显的蛋白条带,测得酶活力为15863 U·mg-1。重组酶酶学性质显示,最适反应温度为60℃,最适pH为9.0。在低于45℃、pH 8.0-8.5时,重组酶具有良好的稳定性。Mn2+、Mg2+和Zn2+能够促进DE3/PLC的酶活力,但Cu2+和Co2+抑制重组酶的酶活力,Ca2+对其酶活力没有影响。DE3/PLC变性温度为65.3℃。(2)重组乳酸克鲁维酵母磷脂酶C(GG799/PLC)经SDS-PAGE分析在35-40 kDa之间有明显的蛋白条带。测得酶活力为19251 U·mg-1,重组酶酶学性质显示,最适反应温度为80℃,最适pH为9.0。当反应温度低于40℃,pH 7.0-8.0时,重组酶具有良好的稳定性。Mn2+、Mg2+、Zn2+及低浓度的Ca2+能够促进重组酶的酶活力,但Cu2+和Co2+却抑制其酶活力。GG799/PLC的变性温度为81.6℃。(3)重组枯草芽孢杆菌磷脂酶C(WB600/PLC)经SDS-PAGE分析在30 kDa附近有明显的蛋白条带。测得酶活为16243 U·mg-1,最适反应温度为60℃,最适pH为9.0。重组酶在反应温度低于40℃,pH 7.0-8.0时具有良好的稳定性。Mn2+、Mg2+和Zn2+能够促进WB600/PLC的酶活力,然而Cu2+和Co2+却对其酶活力有抑制作用,Ca2+对其酶活力没有影响。WB600/PLC的变性温度为67.5℃。(4)本实验优化了磷脂酶C的纯化方法,通过HiPrepTM26/10 Desalting亲和层析柱除去高浓度的咪唑,纯化得到的DE3/PLC和WB600/PLC用卵黄平板法和p-NPPC法均能测到酶活,解决了磷脂酶C纯化失活的现象。通过对GG799/PLC糖基化位点的分析及糖基化的酶切鉴定,证明了乳酸克鲁维酵母表达的磷脂酶C受到了糖基化的修饰。