研究背景及意义间充质干细胞(Mensenchymal Stem Cell, MSCs)是一类主要存在于全身结缔组织或器官间质的具有高度自我更新与多向分化能力的干细胞。由于其具有低免疫原性和免疫调节功能,且有损伤与炎症趋向性,可参与组织修复与再生,因此在多种疾病的治疗研究中有广泛的应用前景。MSCs在肿瘤生物治疗中的潜在应用价值也逐步为人们所认识,主要是利用了MSCs的免疫抑制功能及肿瘤趋向性的特点,例如在白血病患者骨髓移植与肿瘤靶向治疗研究中MSCs可充当辅助治疗细胞或靶向治疗载体。然而目前MSCs对不同恶性表型肿瘤细胞生物学行为的影响尚不明确,因此MSCs在肿瘤治疗应用中的安全性仍存在争议。我们在前期研究中发现与MSCs共培养后不同恶性表型肿瘤细胞基因型变化不同,其中多聚嘧啶区结合蛋白(polypyrimidine tract binding protein, PTB)表达水平的变化存在显著差异。PTB是一种在细胞内部参与mRNA代谢过程的蛋白质,在多数肿瘤组织中表达高于正常组织,被认为是肿瘤治疗的潜在基因靶点。目前PTB的表达水平对肿瘤恶性程度的影响存在争议,可能与肿瘤细胞的类型和生物学特性有关。研究MSCs对不同恶性表型肿瘤细胞生物学特性的影响及相关调控机制,并明确PTB在其中发挥的作用,可为MSCs在不同类型肿瘤治疗研究中的应用提供理论基础,同时也为PTB作为肿瘤治疗基因靶点的有效性和安全性提供实验参考。研究目的1.明确骨髓间充质干细胞(BMSCs)对不同恶性表型人结直肠癌细胞在体外和体内的影响,探讨MSCs对不同恶性表型肿瘤细胞生物学特性的调控作用及机制；并通过脂肪间充质干细胞(ADSCs)对不同恶性表型乳腺癌细胞的体外作用进行验证。2.明确BMSCs与不同恶性表型人结直肠癌细胞隔离共培养前后PTB及其相关信号通路中信号分子表达水平的变化,探讨MSCs差异性调控不同恶性表型肿瘤细胞中PTB表达水平的机制；并通过慢病毒介导的shRNA敲减技术研究PTB在不同恶性表型肿瘤细胞中的功能。研究方法1. BMSCs对不同恶性表型人结直肠癌细胞的作用研究体外培养不同恶性表型人结肠癌细胞系HT29与HCT116,倒置显微镜下观察细胞形态；通过MTS法检测细胞的增殖能力；利用transwell法检测细胞的侵袭能力；运用软琼脂克隆形成实验检测细胞的克隆形成能力；并用real-timePCR定量检测上皮类(E-cadherin)和间充质类(Vimentin)细胞标志基因的表达,鉴定HT29与HCT116细胞的生物学特性；再采用全骨髓血贴壁培养法分离培养健康志愿者髂骨骨髓来源的骨髓间充质干细胞(Bone marrow derived mesenchymal stem cell, BMSCs),经体外扩增2代后分别与HT29和HCT116进行隔离共培养,在第3天和5天比较共培养组与对照组HT-29和HCT116的细胞形态、增殖、侵袭、软琼脂克隆形成能力以及肿瘤恶性相关信号通路蛋白表达等指标的差异,探讨BMSCs对HT29和HCT116生物学特性的差异性调控作用。最后将HT29与HCT116分别与BMSCs在体外隔离共培养1周后注射至裸鼠皮下,比较各组细胞在体内的成瘤时间、成瘤体积和瘤体组织的分化程度等指标的差别。2.PTB在BMSCs差异性调控HT29与HCT116中的功能研究通过real-time PCR与Western Blot的方法检测PTB及其相关信号通路中上下游信号分子基因及蛋白表达水平的变化,明确HT29与HCT116分别与BMSCs共培养过程中PTB信号通路的变化；并用加尾法real-time PCR定量检测相关miRNAs的表达水平,探讨BMSCs差异性调控HT29和HCT116中PTB表达水平的机制。再通过慢病毒介导的shRNA敲减技术敲低HT29和HCT116中PTB的表达,检测HT29和HCT116生物学特性的改变,再利用real-time PCR与westernblot的方法检测EMT调节基因、肿瘤干性基因及肿瘤恶性相关的信号通路蛋白分子表达水平的变化,探讨PTB在BMSCs差异性调控HT29与HCT116生物学特性中的功能。3. ADSCs对不同恶性表型乳腺癌细胞作用的体外研究体外培养不同恶性表型的乳腺癌细胞系MCF7(雌激素受体阳性细胞)与MDA-MB-231(三阴性乳腺癌细胞),通过比较两种细胞的形态、增殖、侵袭和软琼脂克隆形成能力,鉴定其生物学特性；再从整形吸脂术中废弃的脂肪组织中分离培养脂肪间充质干细胞(adipose derived mesenchymal stem cell, ADSCs),经体外扩增3代后分别与MCF7和MDA-MB-231隔离共培养,在共培养第3天和第5天检测共培养组与对照组细胞(单独培养的MCF7/MDA-MB-231)形态、增殖、侵袭、软琼脂克隆形成能力以及上皮间充质转化(Epithelial-mesenchymal transition, EMT)相关标志基因E-cadherin与N-cadherin的表达。研究结果1. BMSCs对不同恶性表型人结直肠癌细胞的作用研究形态学观察结果显示HT29具有上皮类细胞的形态特征而HCT116呈现较强的间充质细胞特征。细胞生物学特性鉴定结果显示HT29的增殖、侵袭和软琼脂克隆形成能力均显著低于HCT116。BMSCs分别与HT29和HCT116体外隔离共培养实验后可显著促进HT29的增殖、侵袭和软琼脂克隆形成能力,但对HCT116的影响不明显；其机制可能是通过上调HT29中GSK3β、AKT、STAT3和ERK1/2的蛋白磷酸化水平实现的。体内成瘤实验结果显示HT29与BMSCs共培养后成瘤时间缩短,形成的肿瘤体积增大,且分化程度降低。与体外实验结果一致,HCT116与BMSCs共培养前后其体内成瘤能力未见显著改变。2.PTB在BMSCs差异性调控HT29与HCT116中的功能研究与BMSCs体外隔离共培养可显著下调HT29中PTB基因与蛋白及其上游转录因子c-MYC及下游细胞周期调节蛋白p27和细胞凋亡调节蛋白CASP3基因的表达,但对HCT116中PTB信号通路无显著影响。此外,与BMSCs共培养后介导PTB表达下调的miRNAs (miR-133, miR-124, miR-339, miR-149)在HT29中的表达均显著升高,但在HCT1 16中的变化不一致；敲低PTB可显著抑制HT29的细胞增殖与克隆形成能力,上调其细胞侵袭能力,并降低HT29在裸鼠体内的成瘤体积和瘤体组织的分化程度；其机制可能是通过改变FGFR2与CD44的选择性剪接方式,上调Twist1和ALDH1基因的表达,提高GSK3β和AKT蛋白的磷酸化水平,促进Notch胞内结构域(Notch intracellular domain, NICD)的合成以及降低P27蛋白的水平来实现的；与HT29不同,敲低HCT116中PTB的水平可显著抑制细胞的增殖、侵袭、软琼脂克隆形成能力和体内成瘤能力,HCT116中ALDH1的基因表达水平以及NICD和磷酸化STAT3的蛋白表达水平也显著下降。3. ADSCs对不同恶性表型乳腺癌细胞作用的体外研究细胞形态学观察结果显示MCF7具有典型的上皮类细胞形态特征而MDA-MB-231呈现较强的间充质类细胞特征；生物学特性鉴定结果显示在体外培养条件下MCF7的增殖、侵袭和软琼脂克隆形成能力均显著低于MDA-MB-231.与ADSCs隔离共培养后MCF7的细胞增殖、侵袭和软琼脂克隆形成能力均显著升高,EMT标志基因E-cadherin表达下降而N-cadherin的表达增高。此外,ADSCs对恶性表型高的MDA-MB-231细胞的体外增殖、侵袭、软琼脂克隆形成能力的影响不明显。结论1. BMSCs可通过提高GSK3β、AKT、STAT3、ERK1/2的蛋白磷酸化水平激活相关通路,促进人结直肠癌细胞HT29的增殖、侵袭、软琼脂克隆形成能力和体内成瘤能力,并降低其形成瘤体组织的分化程度,但对HCT116的作用并不明显。提示BMSCs对不同恶性表型肿瘤细胞的调控作用不同,可诱导低恶性表型HT29细胞向高恶性表型细胞转变,但对高恶性表型HCT116细胞的作用不明显。2.在体外隔离共培养条件下BMSCs可显著抑制HT29中PTB表达及相关的信号通路。敲减PTB可提高HT29的体外侵袭能力并降低其体内成瘤后瘤体组织的分化程度,其机制可能是通过调节FGFR2与CD44的选择性剪接,促进Twist1和ALDHl基因的表达,增高P-GSK3β、p-AKT、NICD并降低P27的蛋白表达实现。提示PTB表达的异常降低可能是低恶性表型HT29向高恶性表型转变的一个“开关”,BMSCs可能通过抑制PTB相关信号通路促进HT29恶性表型的增高。3.在体外隔离共培养条件下BMSCs对高恶性表型HCT116中PTB及相关信号通路无显著影响。但敲减PTB可显著抑制HCT116的细胞增殖、侵袭、软琼脂克隆形成和体内成瘤能力,并降低肿瘤干性相关基因ALDH1和肿瘤恶性相关信号通路蛋白NICD与磷酸化STAT3的表达。提示PTB参与不同恶性表型的肿瘤细胞生物学行为的信号通路不同并发挥不同作用,相应BMSCs对于不同恶性表型的肿瘤细胞中PTB的调节作用也不同。4. ADSCs可通过诱导EMT的发生促进低恶性乳腺癌细胞MCF7向高恶性表型肿瘤细胞的转变,但对高恶性表型MDA-MB-231细胞的生物学特性影响不明显。进一步提示不同组织来源的MSCs可能通过不同的机制,差异性调控不同恶性表型肿瘤细胞生物学行为的变化；为不同类型肿瘤治疗研究以及肿瘤术后组织重建研究中MSCs的应用提供理论基础。