论文部分内容阅读
N~6-methyladenosine(m~6A)是第一个被发现的可逆的RNA修饰,也是分布最广泛的RNA修饰,在RNA的代谢及功能中发挥重要作用。早在40年前已发现病毒RNA含有m~6A修饰,但由于技术和知识的限制,病毒m~6A的功能并不清楚。直到最近才有报道称m~6A修饰存在于艾滋病病毒、流感病毒、黄病毒等病毒的RNA并调控病毒的感染与复制。目前关于病毒m~6A修饰及其功能的研究较少且分子机制不清楚,病毒m~6A的研究在未来一段时间仍将是病毒表观遗传学研究的热点和难点。为研究EV71 RNA m~6A修饰的功能,我们首先使用UHPLC、MeRIP-Northern Blot和MeRIP-Seq等方法证明EV71基因组RNA的VP、2C和3D等蛋白编码区含有m~6A修饰。使用Western Blot检测,我们发现EV71感染导致宿主m~6A修饰甲基化酶和结合蛋白表达增加而去甲基化酶表达降低,免疫荧光结果显示这些蛋白的细胞定位发生了改变。为验证m~6A修饰对病毒复制的影响,我们敲低了甲基化酶和去甲基化酶,发现病毒的复制分别被抑制和增强;另外,敲低m~6A结合蛋白,EV71的复制也受到明显影响。为进一步验证m~6A的功能,我们突变了EV71 RNA的m~6A位点,发现病毒复制被明显抑制。这些结果说明m~6A修饰影响病毒复制。最后,我们探索了m~6A修饰系统影响病毒复制的分子机制。质谱结果显示甲基化酶METTL3和EV71的3D蛋白存在相互作用,Western Blot和免疫荧光结果进一步证实了这一相互作用。通过改变METTL3的表达,我们发现3D蛋白的稳定性被影响。由于有报道称SUMO化和泛素化影响3D蛋白的稳定性和RNA聚合酶活性,因此METTL3可能通过这一途径影响病毒的复制。SUMO化和泛素化检测发现:METTL3促进3D的SUMO化和泛素化修饰,说明METTL3可通过影响3D蛋白的转录后修饰影响病毒复制。综上所述,我们发现EV71 RNA含有m~6A修饰且m~6A修饰系统在病毒感染过程中发挥重要功能。我们的研究有助于进一步了解病毒m~6A修饰的功能,对今后病毒表观遗传学的研究具有借鉴意义,同时为病毒的防治提供了新的思路和可能的药物靶标。