龟类属于变温动物,温度对其胚胎发育、孵化期、孵化率、幼体表型、生长速度、免疫机能等均具有重要影响。在龟卵孵化过程中,孵化介质湿度也对孵化期、孵化率、幼体表型等具有重要影响。在龟类养殖实践中发现,温室养殖的龟类通常在温度波动条件下容易生病死亡,而室外养殖的龟类则能够较好适应温度的变化。乌龟(Mauremys reevesii)和黄喉拟水龟(Mauremys mutica)是我国大量养殖的两种龟类,由于取材较易,被广泛作为研究龟类生态进化等相关科学问题的实验材料,具有重要的科研和经济价值。目前,在温度和湿度对乌龟和黄喉拟水龟胚胎发育影响方面已经进行一些研究,但现有研究对温度的设置范围仍较为局限,尤其缺乏对高温和低温胁迫下的有关实验研究,也缺乏对温湿度协同作用的研究;在免疫机能研究方面,尚未见温度胁迫对温室和室外个体免疫机能差异影响的研究。研究温度对龟类胚胎发育以及免疫机能的影响有助于揭示龟类对温度的适应规律,研究结果可为龟类人工养殖条件的改良提供重要参考依据。因此,一方面,本文以乌龟卵为材料,利用精准控温技术研究温湿度条件对龟胚胎发育、幼体特征的影响;另一方面,以黄喉拟水龟为材料,主要利用磷酸苯二钠法酶检测、荧光定量PCR等技术研究温度对龟免疫相关酶活性及基因表达的影响。主要研究结果包括以下4个部分:(1)乌龟胚胎发育的适宜温湿度条件本研究在 5 个温度梯度水平(23±0.5℃、26±0.5℃、29±0.5℃、32±0.5℃和 35 ±0.5℃和3个湿度水平(蛭石与水的质量比,1:0.5、1:0.9和1:1.2)下孵化乌龟卵,旨在了解温湿度条件对乌龟胚胎发育、幼体表型、运动机能及生长速度的影响。结果表明:孵化期(ID)随温度(T)升高呈非线性下降,二者之间关系可用二项式方程表示:ID=0.5498T2-36.137T+654.56。23℃、26℃和 29℃条件下卵孵化率显著高于 32℃和35℃(p<0.05)。35℃孵化幼体畸形率显著高于其他温度(p<0.05)。23℃和26℃孵化幼体体重和体型显著大于29℃和32℃(p<0.05)。26℃和29℃孵化幼体运动机能较好。然而,当幼体生长至3月龄时,各温度条件下孵化幼体体重和运动机能均无显著差异(p>0.05)。当幼体生长至12月龄时,23℃和35℃孵化幼体存活率显著低于26℃、29℃和32℃(p<0.05)。湿度对孵化期有显著影响,高湿度(1:1.2)条件下孵化期短于低湿度(1:0.5或1:0.9)条件下的孵化期,而湿度对孵化率、幼体表型、运动机能、生长速度及存活率均无显著影响(p>0.05)。研究发现在29℃和1:1.2湿度条件下,孵化期较短、孵化率和幼体存活率较高,是乌龟卵孵化的适宜条件。(2)低温条件对乌龟胚胎滞育及发育的影响本研究在 5 个低温梯度水平(13±0.5℃、15±0.5℃、17±0.5℃、19±0.5℃ 和 21 ±0.5℃)和 10 个处理时间段(5d、10 d、15 d、20 d、25 d、30 d、45 d、60 d、75 d 和90 d)探讨不同低温和处理时间对乌龟胚胎滞育及发育效果的影响。结果表明:在15℃、17℃、19℃和21℃条件下,各处理时间组孵化期均显著短于对照组(p<0.05),且随着处理时间延长,孵化期呈下降趋势,说明胚胎在该温度范围内仍缓慢发育;在13℃条件下,各处理时间组孵化期与对照组无显著差异(p>0.05),说明胚胎在该温度下停滞发育。在21℃条件下,4个处理时间段(5 d、10 d、25 d和30 d)孵化率显著低于对照组(p<0.05),处理时间大于60 d时幼体畸形率显著高于对照组(p<0.05);在19℃条件下,6个处理时间段(5 d、30 d、45 d、60 d、75 d和90 d)孵化率显著低于对照组(p<0.05),处理时间大于30 d时幼体畸形率显著高于对照组(p<0.05);在17℃、15℃和13℃,9个处理时间段(除5d外)孵化率显著低于对照组(p<0.05),在17℃和15℃,处理时间大于10 d时幼体畸形率显著高于对照组(p<0.05),13℃处理时间大于5 d时幼体畸形率显著高于对照组(p<0.05)。结果表明,随着温度降低和低温处理时间增加卵孵化率逐渐下降、幼体畸形率逐渐升高。(3)温度条件对黄喉拟水龟存活率及两种非特异性免疫相关酶活性的影响本研究在3个温度水平(24℃、28℃和32℃)饲养1龄和2龄黄喉拟水龟幼体,对其存活率进行监测,并分别于饲养的第30 d、60 d、90 d、120 d和150 d采集血液样品,比较不同温度下饲养幼体血液中非特异性免疫相关酶活性的差异,了解不同温度条件对黄喉拟水龟幼体免疫机能的影响。结果表明:1龄幼体饲养时间超过90 d时,32℃条件下幼体存活率显著低于24℃和28℃(p<0.05);饲养120 d时,血清酸性磷酸酶(ACP)和碱性磷酸酶(AKP)活性显著低于24℃和28℃条件下的幼体(p<0.05);2龄幼体饲养150 d时,32℃条件下幼体的存活率、血清ACP和AKP活性显著低于24℃和28℃条件下的幼体(p<0.05)。结果表明,高温(32℃)对黄喉拟水龟幼体血清ACP和AKP活性具有一定的抑制性,进而推测高温胁迫可能抑制了机体的非特异性免疫能力,这可能是导致死亡率增加的原因之一。(4)温度胁迫下温室和室外两种模式养殖黄喉拟水龟转铁蛋白mRNA表达的差异本研究将温室和室外养殖的2龄黄喉拟水龟分别放入水温为24℃和32℃的恒温培养箱中进行急性冷应激和急性热应激实验,分别于应激处理3 h、6 h、12 h、24 h和48 h时取样,每个时间点两种养殖模式各随机选取3只个体,未经应激处理的作为对照组(28℃),检测肝脏组织中免疫相关基因(转铁蛋白,TF)表达量。结果表明:温室养殖个体经急性冷应激处理后,有3个应激处理时间点(3 h、6 h和48 h)TF mRNA表达量与对照组存在显著差异(p<0.05),急性热应激处理后,有2个应激处理时间点(6 h和12 h)TF mRNA表达量与对照组存在显著差异(p<0.05)。而室外养殖个体的表达模式不同,急性冷应激处理后,所有应激处理时间点(3 h、6 h、12 h、24 h和48 h)TF mRNA表达量与对照组无显著差异(p>0.05),急性热应激处理后,2个应激处理时间点(12 h和24 h)TF mRNA表达量与对照组存在显著差异(p<0.05)。结果表明:急性冷应激可能影响温室养殖个体的免疫机能,但对室外养殖个体无显著影响;而急性热应激可能主要影响室外养殖个体的免疫机能,对温室养殖个体影响较小。