研究背景乳腺癌是全世界女性发生的最常见恶性肿瘤之一,约占女性新发癌症总数的1/4,其死亡率占女性癌症的15%,位居女性恶性肿瘤死亡率之首,随着社会的发展和人们生活水平的提高,其发病率呈逐年上升趋势,严重威胁着女性的生命和健康,对经济、社会、家庭及女性的精神及心理方面造成了极大的影响。近年来,乳腺癌的预防工作受到人们越来越多的关注,研究工作者通过建立不同用途的乳腺癌动物模型,探讨乳腺癌的病因及发生发展机制,将对乳腺癌的防治工作具有重要价值。研究表明乳腺癌的发生是一个连续的多步骤过程,即从正常组织、普通增生、不典型增生、原位癌至浸润性癌的过程。学者们认为在癌前病变及其之前阶段是可以逆转的,因此,复制这一连续变化过程、明确其发生机制及组织病理学变化,将有助于人们寻找有效措施及时预防与控制乳腺癌的发生。鉴于乳腺是一个激素依赖性器官,雌激素的主要作用是促进乳腺导管生长及导管上皮细胞的增生,孕激素在此基础上,促进了乳腺小叶和腺泡的充分发育。同时,7,12二甲基苯蒽(7,12-dimethylbenz-(a)anthracene, DMBA)作为一种动物实验模型常用的致癌诱导剂,在适合激素水平条件下也可特异性地诱导动物乳腺癌的发生。目前,尽管成功建立了越来越多的乳腺癌实验动物模型,并且为研究乳腺癌的发病机制及治疗策略奠定了基础,但是系统地观察和全面分析这些模型的组织形态学变化的研究还较少。本研究通过DMBA联合雌孕激素诱导斯泼累格·多雷(Sprague-Dawley, SD)大鼠乳腺癌的发生,观察大鼠乳腺的组织病理学变化,并通过标记人类的乳腺病变诊断相关分子P63、CK5/6、CK34βE12及乳腺癌发病机制相关蛋白与基因E-Cadherin、PCNA、Bcl-2等的表达,研究它们在大鼠与人类乳腺癌变过程中的表达差异性及相关性分析,探讨乳腺癌的癌变过程,不但为以后乳腺癌动物模型的进一步研究奠定了组织病理学基础,同时也为研究人类乳腺癌的发病机制及治疗提供了理论依据。第一部分DMBA联合雌孕激素诱导大鼠乳腺癌发生的组织形态学观察目的通过DMBA联合雌孕激素诱导SD大鼠乳腺癌的发生,显微镜下观察大鼠乳腺病变的组织病理学变化。方法50只21日龄、雌性SD大鼠被随机分为5组,分别为G0 (Group 0)、G Ⅰ (Group Ⅰ)、GⅡ (Group Ⅱ)、GⅢ (Group Ⅲ)、GⅣ (Group Ⅲ)。G0:空白对照组,GI:DMBA 15mg/kg, GⅡ:DMBA 20mg/kg, GUI:DMBA 25mg/kg, GIV:DMBA 30mg/kg, G Ⅰ-Ⅳ均分别给予雌二醇苯甲酸酯0.5mg/kg和孕酮4mg/kg,5天为一个周期。每组所得大鼠乳腺标本均进行10%中性福尔马林固定、石蜡包埋、常规4μm厚度切片及苏木素-伊红染色,在光学显微镜下观察,并记录实验第120天、第148天及第180天的每只大鼠乳腺病变类型,包括了乳腺导管增生、小叶增生、间质增生、囊性增生、导管不典型增生、小叶非典型增生、原位癌及浸润性癌,观察标准均采用人类乳腺病变的WHO系统分类法。结果1大鼠乳腺病变的改变包括良性病变、癌前病变,原位癌和浸润性癌,其中良性增生性病变又包括了导管增生,小叶和腺泡的增生,囊性增生,间质增生,而癌前病变主要是导管的不典型增生和小叶的不典型增生。2实验组乳腺病变的发生率在实验第120天,第148天,第180天分别为4.38%、14.06%、34.06%,呈递增趋势,并且第180天发生率最高,第180天实验组乳腺导管增生、导管非典型增生、原位癌到浸润性癌的发生率分别为57.5%、45%、32.5%、22.5%,呈递减趋势。结论DMBA联合雌孕激素可以诱导大鼠乳腺癌发生,并且在实验第12.0天,第148天,第180天可以观察到大鼠乳腺从良性病变到癌前病变,最后变成癌的多步骤、连续的过程。第二部分研究P63、CK5/6和CK34 βE12在大鼠与人类乳腺癌变过程中的表达差异性目的观察SD大鼠和人类乳腺导管病变中P63、CK5/6和CK34 βE12的表达,探讨它们的表达差异性,比较分析SD大鼠和人类乳腺癌发生的异同。方法收集本研究的第一部分实验SD大鼠乳腺及山东省医学科学院附属医院病理科2.013-2014年人类乳腺癌手术切除的存档石蜡标本各10例,每例大鼠和人类乳腺组织的病理结果均经病理医师诊断为浸润性导管癌,并且均可以观察到导管普通型增生、不典型增生、导管原位癌及浸润性导管癌等病变。采用免疫组织化学染色PV-9000二步法检测P63、CK5/6和CK34 β E12的蛋白表达情况,在显微镜下观察计数,采用SPSS17.0统计软件分析：(1)P63、CK5/6和CK34 βE12分别在大鼠和人类乳腺各组病变中的表达差异性；(2)P63、CK5/6和CK34 βE12在大鼠乳腺各组病变与人类乳腺各组病变间的表达差异性。结果1 P63蛋白表达阳性率在大鼠和人类乳腺导管病变之间差异无统计学意义(P>0.05)；P63在大鼠和人类乳腺导管普通型增生、不典型增生、原位癌、浸润性癌中的表达阳性率逐渐减少,组间差异有显著性统计学意义(P<0.01)。2大鼠和人类乳腺组织中,CK5/6、CK34βE12蛋白表达阳性率在导管普通型增生、不典型增生、原位癌、浸润性癌中逐渐减少,组间差异有显著性统计学意义(P<0.01)；而大鼠乳腺病变与人类乳腺病变中的表达阳性率差异无统计学意义(P>0.05)。结论1 P63、CK5/6和CK34 βE12蛋白在大鼠乳腺各组病变的表达与人类乳腺相似,提示大鼠乳腺癌变过程与人类乳腺癌发生基本一致,包括了乳腺导管普通型增生、非典型增生、原位癌到浸润性癌的多步骤的连续过程。2 P63、CK5/6和CK34 βE12作为临床病理诊断常用的人类乳腺肌上皮分子标记,在研究大鼠乳腺病变中具有相同的诊断价值。3大鼠乳腺与人类乳腺有类似的组织形态学变化,为乳腺癌模型研究提供了组织病理学基础,并且可能成为乳腺癌预防与治疗策略研究的理想模型。第三部分研究E-Cadherin、PCNA和Bcl-2在大鼠与人类乳腺癌变过程中的表达差异性及相关性分析目的观察E-Cadherin、PCNA和Bcl-2蛋白在大鼠和人类乳腺导管普通型增生、不典型增生、原位癌、浸润性癌及正常乳腺组织中的表达,探讨它们在大鼠和人类乳腺病变中的表达差异性及相关性分析。方法收集本研究第一部分实验的SD大鼠乳腺导管病变石蜡标本和山东省医学科学院附属医院人类乳腺癌石蜡标本各10例,标本筛选标准同本研究的第二部分实验,采用免疫组织化学染色PV-9000二步法检测E-Cadherin、PCNA和Bcl-2蛋白的表达水平,分别采用PCNA表达的阳性率标记细胞增殖指数(proliferation index,PI)和Bcl-2表达的阳性率标记抗细胞凋亡指数(apoptosis index,AI),观察染色结果并计数阳性细胞数,采用SPSS17.0统计软件分析：(1) E-Cadherin、 PCNA和Bcl-2分别在大鼠和人类乳腺各组病变中的表达差异性；(2) PCNA的表达与E-Cadherin的相关性分析；(3)细胞增殖指数与抗细胞凋亡指数相关性分析。结果1 E-Cadherin蛋白表达水平在大鼠正常乳腺导管、导管普通型增生、不典型增生、原位癌及浸润性癌中逐渐减少,组间差异有显著性统计学意义(P<0.01);E-Cadherin蛋白在人类乳腺病变组织的表达趋势与大鼠一致,并且差异也有显著性统计学意义(P<0.01)。2 PCNA蛋白表达阳性率在大鼠乳腺正常导管、导管普通型增生、不典型增生、原位癌及浸润性癌逐渐增加,组间差异有显著性统计学意义(P<0.01),并且正常导管、导管普通型增生、不典型增生与原位癌之间,两两比较差异有显著性(P<0.01),PCNA蛋白在人类乳腺各组病变的表达水平与大鼠中呈相同的趋势,差异也有显著性统计学意义(P<0.01)。3 Bcl-2蛋白表达水平在大鼠各组乳腺病变中呈递增趋势,组间差异有统计学意义(P<0.01),而在人类乳腺各组病变中的表达趋势类似于大鼠,差异无统计学意义(P>0.05)。4大鼠和人类乳腺病变中,PCNA蛋白的表达强度分数与E-Cadherin的表达呈负相关(P<0.05),而PI与Bcl-2蛋白表达阳性率呈正相关(P<0.05)。结论1乳腺病变由普通型增生、不典型增生、原位癌发展到浸润性癌的过程中E-Cadherin表达逐渐减少,提示E-Cadherin蛋白失表达可能与乳腺癌的发生有关。2 PCNA、Bcl-2蛋白表达水平与细胞增殖和抗细胞凋亡指数随着乳腺病变发展过程呈上升趋势,并且细胞增殖指数与抗细胞凋亡指数呈正相关,推测细胞增殖和细胞抗凋亡的相互作用可能促使了乳腺癌的发生。3 PCNA蛋白的表达强度分数与E-Caadherin的表达呈负相关,提示细胞增殖程度与细胞粘附性可能有关,参与乳腺细胞的癌变。4大鼠乳腺病变中E-Caadherin、PCNA和Bcl-2蛋白的表达与人类有高度一致性,提示大鼠乳腺的癌变过程与人类乳腺癌的发生类似。