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昆虫的天然免疫分为细胞免疫(cellular immunity)和体液免疫(humoral immunity)。昆虫的细胞免疫是指多种血细胞参与的防卫反应,包括吞噬作用(cytophagy)、结节形成(nodulation)和细胞包囊(encapsulation);体液免疫涉及抗菌肽的诱导、酚氧化酶原(prophenoloxidase,PPO)激活导致的黑化反应(melanization)。丝氨酸蛋白酶抑制因子(Serine protease inhibitor,Serpin),是血淋巴中对丝氨酸蛋白酶有抑制作用的一类蛋白质,用来调节昆虫内环境的平衡。β-1,3-葡聚糖识别蛋白(β-1,3-glucan recognition protein,βGRP)作为一种模式识别蛋白,能够识别真菌的细胞壁成分,在昆虫的免疫系统中占有重要地位。 本文利用RT-PCR和RACE扩增技术,克隆了亚洲玉米螟幼虫Serpin2基因的全长cDNA序列。该基因全长1447bp核苷酸,其中包含一个1137bp的开放阅读框(ORF),一个163bp的5非编码区(5UTR)和一个147bp的带有加尾信号的3非编码区(3UTR)。开放阅读框从第164个核苷酸开始,终止于第1300个核苷酸,共编码378个氨基酸。Of-Serpin2的计算分子量约为41.71kDa,估测等电点pI为5.29。生物信息学分析表明:Of-Serpin2无跨膜结构域,N端无信号肽,不存在糖基化位点,含有39个磷酸化位点,均匀分布于整个多肽链中。BlastP分析结果表明:Of-Serpin2的氨基酸序列与尺蠖Lonomia obliqua Serpin2、甜菜夜蛾Spodoptera exigua Serpin2、野桑蚕Bombyx mandarina Serpin2、家蚕Bombyx mori Serpin2、大斑蝶Danaus plexippus Serpin2高度同源。三维结果显示,Of-Serpin2有8个α螺旋,3个β折叠。 利用RNA干扰技术,研究干扰βGRP3基因后亚洲玉米螟幼虫体内与体液免疫相关基因Serpin1、PAP、PPO等的表达情况,以及对细胞免疫能力的初步影响。以DEPC水处理组和绿色荧光报告蛋白(GFP)处理组为阴性对照,制备了βGRP3和GFP的dsRNA,采用注射方法,分别将βGRP3和阴性对照GFP的dsRNA导入4龄初亚洲玉米螟幼虫体内,采用实时荧光定量PCR检测RNAi后幼虫体内Serpin1、PPO、PAP等免疫相关基因在转录水平的变化,进一步分析RNAi对血淋巴中PO活性的影响,探索βGRP3在亚洲玉米螟免疫识别和防卫过程中的功能。结果表明:将βGRP3基因干扰后72h,亚洲玉米螟幼虫体内该基因的表达量开始明显降低(P<0.05),表明注射βGRP3dsRNA可以有效下调βGRP3基因的转录水平。与此同时,其免疫相关基因PAP(酚氧化酶原激活蛋白酶)、PPO(酚氧化酶原)的表达量也显著低于对照;干扰后幼虫体内PO酶活性在72h开始呈现显著下调,这表明Of-βGRP3正调控PO活性,即在PPO级联调控中起重要作用。对干扰后亚洲玉米螟幼虫血细胞观察发现,72h开始,类绛色细胞、浆血细胞和原血细胞的数量开始下降(P<0.05),而粒血细胞数量增加,且浆血细胞在96h后的数量开始回升,同时与对照组相比,处理组的总细胞数并没有发生明显变化(P>0.05),说明宿主昆虫在受到外来入侵物影响时,其血细胞会自行进行免疫调节,以维持宿主昆虫体内的正常生理活动。RNAi后再次注射细菌,发现只注射大肠杆菌处理组的致死中时间(3d)显著大于RNAi处理后二次注菌处理组(1d),结果表明:βGRP3在昆虫抵抗病原菌侵染中起重要作用。