目的神经管畸形(neural tube defects，NTD)是人类常见先天畸形，是影响人口素质的最常见、最严重的出生缺陷性疾病之一。它是由于在胚胎发育过程中，神经管闭合不全所引起的一组缺陷，包括无脑畸形、脑膨出和脊柱裂等。它们在病因学上是多因素的，是遗传学因素和环境因素共同作用结果。胚胎脑发育的早期阶段主要是神经板隆起、弯曲、闭合形成神经管，神经管的头部从前向后依次发育形成脑的基本组织形态，即端脑、间脑、中脑、后脑，在神经管闭合过程中出现异常就会导致NTD。研究表明一氧化氮(nitric oxide，NO)与脑内许多生理功能相关，尤其在神经系统分化过程中扮演重要角色。另有文献报道在鸡胚NO通过细胞凋亡调节细胞数目影响神经管的闭合，从而影响神经管发育。由于NO极不稳定，半衰期短，目前尚无法直接定位组织中NO的分布，主要通过对一氧化氮合酶(nitric oxide synthase，NOS)的定位来反映NO的分布。NOS是催化合成内源性NO的唯一酶，在很大程度上决定着NO的生物学效应。NOS分为3型，分别为神经元型一氧化氮合酶(neuronal NOS，nNOS)；诱导型一氧化氮合酶(inducible NOS，iNOS)；内皮型一氧化氮合酶(endothelial NOS，eNOS)。研究资料表明NO增高可以促使细胞发生凋亡，从而影响神经管的发育，但在三种类型NOS中，究竟是来源于哪一种类型NOS的NO在神经管发育过程中起主导作用目前尚不清楚。因此，本研究采用乙烯硫脲(Ethylenethiourea，ETU)致畸的大鼠神经管畸形动物模型观察nNOS、iNOS、eNOS在胎鼠大脑皮质中表达情况，从血管内皮细胞与神经细胞相互作用影响神经管发育角度，探讨NOS与脑发育异常的关系，希望为脑发育异常机制提供理论根据。材料和方法一、神经管畸形大鼠模型制备与动物分组Wister大鼠80只(中国医科大学第一临床学院实验动物中心提供)体重250～300克。雌雄(比例3：1)交配后，清晨阴道涂片发现精子定为孕0天，在孕10天时，随机选取50只孕鼠为ETU致畸组，经胃管注入1％ETU，剂量为125mg/kg，制作神经管畸形大鼠模型。10只为对照组，注入等量生理盐水。分别在大鼠孕14d、20d时，剖宫取出胎鼠，一部分胎鼠用0.9％的生理盐水10毫升及4％多聚甲醛20毫升分别进行左心室灌注固定，然后在显微镜下取出胎鼠的大脑组织，置于4％多聚甲醛后固定3小时，转入30％蔗糖过夜，将固定好的标本连续冠状冰冻切片或石蜡包埋；另一部分胎鼠在显微镜下分离新鲜未经固定大脑组织，液氮速冻后于-70℃保存。实验分四组：对照组、给药无畸形组、脊柱裂组、脑膨出组。二、神经管畸形胎鼠大脑皮质的病理改变观测1、对E20胎鼠大脑皮质进行HE染色，以明确脑膨出胎鼠大脑皮质的病理结构变化。2、应用细胞凋亡原位检测法检测不同组E20胎鼠大脑皮质神经元凋亡情况，并计算凋亡指数，进行X~2检验。3、应用免疫荧光技术检测bcl-2在E20胎鼠大脑皮质神经元细胞中的分布和表达，应用Western blot法检测胎鼠大脑皮质中caspase-3、bcl-2的蛋白表达半定量分析。三、神经管畸形胎鼠大脑皮质中NOS的差异表达检测1、应用免疫荧光技术检测nNOS、iNOS、eNOS在E20胎鼠大脑皮质神经元和脑血管内皮细胞中的分布和表达，应用免疫荧光技术检测V8脑血管内皮细胞中的分布和表达；应用Western blot法检测胎鼠大脑皮质中nNOS、iNOS、eNOS的蛋白表达半定量分析。2、应用实时定量PCR对nNOSmRNA、eNOSmRNA、iNOS mRNA的表达作相对定量分析。结果一、神经管畸形模型成功制备在大鼠孕10d给予ETU处理后，孕20d剖腹取出胎鼠发现可出现脑膨出、脊柱裂、无尾、肛门闭锁等多种畸形。对对照组、给药无畸形组、脊柱裂组、脑膨出组E20胎鼠大脑皮质进行HE染色，发现给药无畸形组、脊柱裂组与对照组的胎鼠大脑皮质无明显异常改变，而脑膨出组胎鼠大脑皮质明显变薄，细胞数量减少，部分细胞变性(细胞核淡染，肿胀)。二、应用细胞凋亡原位检测法检测不同组E20胎鼠大脑皮质中细胞凋亡情况E20胎鼠大脑皮质中Tunel阳性细胞数目在正常组、给药无畸形组及脊柱裂组细胞凋亡数无明显改变，而在脑膨出组胎鼠大脑皮质细胞凋亡数明显多于对照组，计算凋亡细胞百分率，然后用X~2检验进行分析，脑膨出组和对照组的细胞凋亡指数差异有统计学意义(P<0.05)。三、免疫荧光技术检测E20胎鼠大脑皮质中bcl-2的表达差异E20胎鼠大脑皮质中bcl-2阳性神经元表达量在对照组、给药无畸形组、脊柱裂组无明显改变，而脑膨出组bcl-2阳性神经元表达量明显减少。四、Western-blot检测E14、E20胎鼠大脑皮质中caspase-3、bcl-2蛋白的表达1、用Western-blot方法检测不同组E20胎鼠大脑皮质中caspase-3、bcl-2蛋白表达水平，结果表明对照组、给药无畸形组、脊柱裂组胎鼠大脑皮质中caspase-3、bcl-2蛋白表达水平无明显改变，而脑膨出组胎鼠大脑皮质中caspase-3蛋白活化片段表达水平明显增加，bcl-2蛋白表达水平明显减少。2、用Western-blot方法检测脑膨出组、对照组E14、E20胎鼠大脑皮质中caspase-3蛋白表达水平，结果表明E14、E20脑膨出组大脑皮质中caspase-3活化片段表达明显高于对照组(P<0.01)。五、胎鼠大脑皮质中nNOS、eNOS和iNOS蛋白的差异表达1、利用免疫荧光技术检测到给药无畸形组、脊柱裂组和对照组E20胎鼠大脑皮质中nNOS阳性神经元数量无明显改变，而脑膨出组胎鼠大脑皮质中nNOS阳性神经元数量明显减少，计算平均光密度值发现与其他组相比，脑膨出组胎鼠大脑皮质中nNOS表达量明显减少；给药无畸形组、脊柱裂组和对照组E20胎鼠大脑皮质中eNOS阳性血管数量无明显改变，而脑膨出组胎鼠大脑皮质中eNOS阳性血管数量增多，计算平均荧光密度值发现各组胎鼠大脑皮质中eNOS的表达无明显改变，同样计算V8染色血管数量及平均荧光密度值亦得到同样结果；在各组未检测到iNOS阳性染色。2、在Western blot分析中，发现E20胎鼠大脑皮质中nNOS、eNOS蛋白表达在给药无畸形组、脊柱裂组和对照组间无明显改变，而脑膨出组E20胎鼠大脑皮质中nNOS蛋白表达明显减少，eNOS蛋白表达增加；在各组未检测到iNOS蛋白表达。3、在Western blot分析中，发现与对照组比较，E14脑膨出组胎鼠大脑皮质中nNOS蛋白表达明显减少，eNOS蛋白表达水平明显增加，与E20结果相一致；在E14胎鼠大脑皮质中检测到iNOS蛋白微量表达，但脑膨出组与对照组比较无明显差异，E20胎鼠大脑皮质中未检测到iNOS表达。六、不同组E20胎鼠大脑皮质中nNOS mRNA、eNOS mRNA和iNOS mRNA的表达1、实时定量PCR检测发现对照组、给药无畸形组、脊柱裂组和脑膨出组E20胎鼠大脑皮质中nNOS mRNA表达无明显改变；2、给药无畸形组、脊柱裂组和对照组胎鼠大脑皮质中eNOSmRNA表达无明显改变，而脑膨出组胎鼠大脑皮质中eNOS mRNA表达明显增多；3、在各组未检测到iNOSmRNA表达。结论1、在用ETU成功制备神经管畸形大鼠模型过程中，发现孕10天是获得神经管畸形大鼠模型的最佳给药时间。2、神经管畸形中脑膨出胎鼠大脑组织中eNOS表达升高，引起NO释放增加，可能是通过caspase-3、bcl-2途径促发神经元凋亡，导致神经管闭合缺陷引起脑发育异常，说明eNOS在神经管畸形发育过程中起主导作用。3、脑血管与神经元发育比例失衡，可能也是脑发育异常的一个重要因素。