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目前已分离出一些昆虫几丁质酶,并且已将昆虫几丁质酶基因导入到植物中以增强植物的抗虫性,及将几丁质酶嵌入到昆虫病原体内,增强昆虫病原体对害虫的为害。本文从小地老虎体内分离和表达了几丁质代谢相关酶基因,详细了解其分子特性对研究和开发几丁质代谢相关酶为基础的杀虫剂是十分必要的。从预蛹期小地老虎体内分离出两条几丁质酶基因cDNA序列,一条是全长基因序列,另一条是包含5’端的基因片段。全长的小地老虎几丁质酶基因cDNA序列长度为2823bp,包括1677个碱基的开放读码框,编码558个氨基酸,分子量为62.5 kDa。5’端的几丁质酶基因cDNA序列片段长度为1082bp,编码360个氨基酸。由全长几丁质酶基因推导的氨基酸序列包含两个保守区域,一个是N-端的高度保守的几丁质催化区,另一个是C-端包括六个半胱氨酸的几丁质结合区。在催化区和几丁质结合区中间有一个被称为Linker的富含脯氨酸、丝氨酸、苏氨酸和谷氨酸的区域(PEST富集区)。预测其成熟期蛋白的N-端还含有一个疏水性的信号肽。从已发现昆虫几丁质酶基因推导的氨基酸序列中的N-位和O-位糖基化的位点的确定,对于研究昆虫蛋白的分泌和维持其稳定性是必要的。利用PROSCAN和NetOGlyc 2.0软件发现在小地老虎几丁质酶氨基酸序列中有2个N-位糖基化位点和20个O-位糖基化位点。从预蛹期小地老虎体内分离出两条包含3’端的β-N-乙酰葡糖胺糖苷酶基因的cDNA序列。其中一条的长度为2267bp,包括1509个碱基的开放读码框,编码503个氨基酸,分子量为57.6kDa。另一条的长度为2278bp,包括1509个碱基的开放读码框,编码503个氨基酸,分子量为57.5kDa。两条β-N-乙酰葡糖胺糖苷酶基因推导的氨基酸序列都包含两个保守区,一个是N-端的水解催化区,另一个是C-端的水解结合区。利用PROSCAN和NetOGlyc 2.0软件发现在两条小地老虎β-N-乙酰葡糖胺糖苷酶氨基酸序列中都有3个N-位糖基化位点和1个O-位糖基化位点。从取食期小地老虎体内分离出一条几丁质合成酶基因cDNA序列,长度为975bp,包括792个碱基的开放读码框,编码264个氨基酸,分子量为30.0kDa。利用BLAST搜寻出许多与小地老虎几丁质酶基因具有高同源性的昆虫基因。其推导的氨基酸序列与烟草天蛾相应序列推导的氨基酸序列同源性为80%,与棉铃虫同源性为85%,与美国白蛾同源性为83%,与斜纹夜蛾同源性为89%。序列比对表明小地老虎几丁质酶基因与其他鳞翅目昆虫的几丁质酶基因显示高同源性(75%以上)。利用BLAST搜寻出与小地老虎β-N-乙酰葡糖胺糖苷酶基因具有高同源性的昆虫基因。其推导的氨基酸序列与烟草天蛾相应片段推导的氨基酸序列同源性为73%,与草地贪夜蛾同源性为37%,与玉米螟同源性为74.4%。利用BLAST搜寻出与小地老虎几丁质合成酶基因具有高同源性的昆虫基因。其推导的氨基酸序列与烟草天蛾相应序列推导的氨基酸序列同源性为79%,与甘蓝夜蛾同源性为92%,与甜菜夜蛾同源性为89.4%。克隆出的小地老虎几丁质代谢相关酶基因的cDNA序列已分别登录在GenBank上,登录号分别为:几丁质酶基因EU035316,EU622802;β-N-乙酰葡糖胺糖苷酶基因EU622803,EU622804;几丁质合成酶基因EU601174。利用RT-PCR方法对小地老虎体内不同时期的几丁质代谢酶基因的时空表达进行了研究。结果表明,幼虫蜕皮和预蛹期有几丁质酶和β-氮-乙酰葡糖胺糖苷酶的mRNA表达,而在幼虫取食期只有几丁质合成酶的mRNA表达。