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黄曲霉毒素B1(Aflatoxin B1,AFB1)和玉米赤霉烯酮(Zearalenone,ZEA)同是存在于谷物中有害物质,是霉菌污染谷物所产生的次级代谢产物。AFB1为剧毒和强致癌物质,可同时诱发多种癌症;ZEA具有很强的类雌激素作用,能够破坏人和动物正常生殖发育,这两种毒素普遍存在于谷物中,对人类的健康和安全造成严重威胁。目前常用的检测方法操作复杂、耗时长、需要专门的仪器且只能检测一种毒素,因此研制能够快速、方便、准确的同时检测谷物中AFB1和ZEA免疫层析试纸条具有重要意义。本实验主要对以下三个方面进行研究:1.采用碳二亚胺法(DCC法)将AFB1和ZEA同载体蛋白OVA偶联制成完全抗原(AFB1-OVA和ZEA-OVA)。测定其蛋白浓度分别为1.68和2.25mg/mL;紫外分光光度计扫描,分别在360nm和310nm波长附近出现一个新的吸收峰;SDS-PAGE电泳分析,AFB1-OVA纯度良好,ZEA-OVA略含杂质条带;OVA同毒素偶联比分别为12.3:1和16.5:1;完全抗原稳定性良好,等体积混合甘油,-20℃保存,300天内检测结果未发生明显变化。2.采用柠檬酸三钠还原法制备颗粒直径40nm胶体金溶液,紫外分光光度计和透射电镜分析,颗粒均匀且分散度良好,平均直径为40.2±0.4nm;采用无血清培养技术制备抗AFB1单克隆抗体,亲和层析法对其进行纯化。抗AFB1单克隆抗体和抗ZEA单克隆抗体效价分别为1:8×104和1:1.28×105;SDS-PAGE电泳分析,亲和层析有效去除上清液中杂质蛋白,抗AFB1单克隆抗体和抗ZEA单克隆抗体纯度良好。胶体金标记两种抗体的最适标记pH分别为7.5和7.0,最适蛋白浓度分别为5.0和2.5μg/mL。选取Milipore 135s为试纸条的检测区,检测线上AFB1-OVA和ZEA-OVA最适包被浓度分别为1.0和2.0 mg/mL,在此基础上制备可同时定性检测AFB1和ZEA试纸条,其最低检测限分别达到5和50μg/kg。3. AFB1检测试纸条、ZEA检测试纸条和同时检测AFB1和ZEA试纸条检测液最适甲醇含量分别为30%、20%和20%;与AFM1和DON未发生交叉反应;可以检测出浓度分别为5和50 ng/mL AFB1和ZEA的溶液以及两种毒素混合溶液;重现性分别为100%、95%和95%;4℃下保质期分别为1年、1年和9个月。使用试纸条和ELISA法检测北方地区采集的92份谷物样品,5份样品检出AFB1浓度高于5μg/kg,9份样品检出ZEA浓度高于50μg/kg,试纸条和ELISA法检测结果完全相符,采用TLC法检测阳性样品,与试纸条测定结果一致,说明试纸条准确性良好。