铁皮石斛是我国珍稀药材，了解种质资源遗传多样性，有助于选育优良新品种、合理利用和保护种质资源。采用SCoT和SSR标记技术，建立铁皮石斛SCoT-PCR、SSR-PCR反应体系。分析铁皮石斛遗传多样性，结果如下：1、通过正交试验设计和单因素实验相结合，建立铁皮石斛SCoT-PCR最佳反应体系（20μL）：DNA模板30ng，Mg²⁺2.5mmol·L^-1、dNTPs0.15mmol·L^-1、Taq酶1.5U、引物0.4μmol·L^-1。PCR扩增程序：94℃，5min；94℃，35s，51℃，35s，72℃，1.5min，35个循环；72℃，10min，SCoT标记在32份铁皮石斛材料的验证中表现出良好的稳定性和可重复性。利用SCoT分子标记对铁皮石斛个体和居群进行遗传多样性和聚类分析，从57条SCoT引物中筛选出28条引物，共扩增出385条带，其中366条为多态性条带，多态性比率（PPB）94.76%；17个居群的多态位点（PPL）在28.83%⁶4.42%，平均为45.73%，聚类结果表明不同来源的铁皮石斛聚在一起，但有例外，说明铁皮石斛种质具有丰富的遗传多样性。2、铁皮石斛SSR-PCR最佳反应体系（20μL）：Mg²⁺1.5mmol·L^-1、引物0.6μmol·L^-1和dNTPs0.40mmol·L^-1、Taq DNA聚合酶0.5U、模板DNA40ng；SSR-PCR扩增反应程序：95℃，5min，95℃，35s，（41-58.1）℃，35s，72℃，1.5min，35个循环；72℃，10min；利用该反应体系对95份铁皮石斛进行SSR-PCR扩增，扩增谱带多态性丰富。利用SSR分子标记对铁皮石斛个体和居群进行遗传多样性和聚类分析，从26个SSR引物中筛选出10对引物，共扩增出63条带，其中61条为多态性条带，多态性比率（PPB）97.00%；17个居群的多态位点（PPL）在11.11%⁹0.48%，平均为53.22%。聚类结果表明铁皮石斛遗传多态性丰富，居群间遗传差异较大。3、将SCoT和SSR标记相结合对17个居群的铁皮石斛进行遗传多样性分析，结果表明铁皮石斛遗传多样性主要分布于居群间，铁皮石斛种质的亲缘关系与其地理纬度具有显著的相关性。聚类结果表明，SCoT和SSR标记相结合能够更明确了不同来源的铁皮石斛种质资源的亲缘关系和地理纬度关系密切。更进一步证明了SCoT和SSR标记对铁皮石斛遗传多样性、亲缘关系分析的可靠性，为铁皮石斛品种的选育、引种和推广提供了可靠的理论依据。