传统的荧光探针大多采用单光子激发,其激发波长通常在可见光区,这导致其用于生物成像时容易产生光漂白现象,受生物体系自发荧光的干扰,以及较小的组织穿透深度(<100μm)。而双光子荧光探针采用双光子近红外光激发,可以在深层组织观察,而且可以延长观察时间,因此在生物成像方面的研究更受青睐。尽管双光子具有大的穿透深度(理论上可达500μm),可降低荧光背景,减小瑞利散射和组织损伤,但是已经报道的双光子荧光探针一般都是基于单个荧光发射峰的强度改变而设计的,而且发射波长范围一般落在可见光区。因此这些探针容易受到其它因素的干扰,如探针浓度,环境条件,仪器效率等。而比率型荧光探针可以消除上述因素的影响。本文在广泛查阅相关文献的基础上,针对双光子荧光探针在分辨率和穿透深度等方面存在的问题开展研究工作。首先,把一个具有D-π-A结构的双光子荧光团与罗丹明B通过跨键能量转移(TBET)策略偶联,构建了一个新型比率型双光子荧光探针平台,并将它们用于细胞和组织内的金属阳离子和p H的检测成像,得到具有高分辨率和强穿透能力的荧光探针;其次,我们设计合成具有固态发光的双光子荧光探针,得到自定位原位成像的高分辨率双光子荧光探针;最后,设计合成了具有近红外发射的双光子荧光平台,用以解决传统双光子染料在可见光区发射、穿透深度和光稳定性等问题,并用此平台成功的设计合成了具有近红外发射的H2S双光子荧光探针。具体内容如下:1.设计并合成了比率型双光子荧光探针平台用于检测细胞和组织中的铜离子。在第二章中我们把一D-π-A结构的萘衍生物双光子荧光团与具有螺环结构的罗丹明B衍生物通过跨键能量转移策略连接起来,得到了大的双光子活性吸收截面、大的双发射峰位移、高分辨率和强穿透能力的荧光探针平台,这种设计方法拓宽了双光子染料的种类,解决了传统比率型双光子染料基于一个荧光团的波谱移动所带来的小的发射峰位移的问题。并以铜离子作为模型构建了荧光探针。我们考察了荧光探针对铜离子的响应特性,对铜离子的检测下限为3.0×10-7 M。实验结果表明,在p H 2.0-10.0,该化合物对铜离子的响应几乎不受p H的影响。此外,该探针对铜离子具有很好的选择性,将其用于细胞和组织成像,得到了较高的分辨率和较深的组织穿透深度(70-180μm)。2.基于第二章的比率型双光子探针平台,第三章中我们设计并合成了一个钯离子比率型双光子荧光探针。此探针是基于跨键能量转移(TBET)机理设计的,实现了单激发,双发射检测Pd(II)。该探针同样由一个D-π-A结构的萘衍生物双光子荧光团和具有螺环结构的罗丹明B衍生物组成,酰胺希夫碱单元可以与Pd(II)形成配合物(配合比为1:1)而使罗丹明B的螺环结构开环,从而导致了该探针的两个发射峰的荧光强度的显著变化。我们考察了该荧光探针对Pd(II)的响应特性,其最大信背比可达31.2,灵敏度高,对Pd(II)的检测限为2.3×10-7 M,实验结果还表明,在p H 2.0-8.0,该化合物对Pd(II)的响应几乎不受p H的影响,并且对Pd(II)具有良好的选择性。探针的两个发射峰的位移为100 nm,可以有效避免成像时两个通道的光相互干扰,将该探针用于细胞和组织成像,得到了较高的成像分辨率和较深的组织穿透深度(90-270μm)。3.在第二章开发的比率型双光子探针平台的基础上,第四章中我们选取了一个更加常见、便宜易得的双光子荧光团:4-取代-1,8-萘酰亚胺,将其与具有螺环结构的罗丹明B衍生物通过跨键能量转移策略连接起来,构建了一个溶酶体定位的p H比率型双光子探针。该探针具有较强的溶酶体定位能力,选择性高,细胞毒性小。用于比率型荧光成像研究,两个通道之间的光的相互影响小,将其用于洋葱组织的比率成像,分辨率高,穿透深度为90-180μm。4.基于2-(2-羟苯基)-4(3氢)-喹啉酮(HPQ)的固态发光原理,第五章中我们设计合成了一个具有高时空分辨率的光激活的荧光成像探针PHPQ。在体外我们首先采用硅胶板实验验证了HPQ在水介质中不会扩散,而传统的荧光染料7-羟基香豆素会很快地在水中扩散开;我们进一步合成了带有光控基团和线粒体定位基团的7-羟基香豆素衍生物PCM,共定位实时成像的结果表明,光激活切断PHPQ探针的定位基团后,得到的HPQ能牢牢的定位在线粒体上,而光激活切断PCM探针的定位基团后,得到的香豆素则在细胞内扩散了,定位效果很差。实验结果表明HPQ具有能自定位原位成像的能力。同时,我们首次证明了HPQ具有双光子性质,其双光子吸收截面(95 GM)可以与传统的D-π-A-双光子荧光团媲美,我们用洋葱组织进行了深度扫描,其有效的穿透深度为(80-220μm)。5.第六章中我们设计并合成了一类具有近红外发射的双光子荧光染料平台TP-NI3。TP-NI3具有较好的光稳定性,在p H=2-8的条件下,荧光强度的变化较小,单光子和双光子成像时具有很高的分辨率,而且可以定位线粒体成像。更重要的是它可以用于动物成像,类似于吲哚绿(ICG),属于原代谢探针,经过尾静脉注射后,可以很快的穿过血脑屏障,最后聚集于肾脏。我们进一步将TP-NI3的氨基变成对硫化氢特异性响应的叠氮基合成了一个双光子近红外荧光探针,该探针成功地检测了细胞内内源性和外源性的硫化氢。