肝转移的高发生率是结直肠癌的一个特征，日益受到临床上的重视。15%～25%的结肠癌病人在诊断时已发生肝转移，20%～35%病例转移灶仅出现在肝脏，而50%～70%的晚期病人会出现肝转移[1,2]。结肠癌的预后主要与有无远处转移尤其是肝转移密切相关。如何抑制结直肠癌的肝转移，是目前临床上遇到的重点问题。上皮细胞-间充质转化(epithelial-mesenchymal transition, EMT)是指上皮细胞通过复杂的程序转化为具有间质表型细胞的生物学过程，是上皮细胞来源的恶性肿瘤细胞获得转移和侵袭能力的重要生物学过程，通过EMT上皮细胞失去了细胞极性，失去与基底膜的连接等上皮表型，降解细胞外基质（Extracellular matrix,ECM）蛋白的能力等间质表型，从而获得了较高的迁移与侵袭[3]，其中基质金属蛋白酶（Matrix metalloproteinases, MMPs）在降解细胞外基质、E-钙粘蛋白(E-Cadherin)在减少细胞间黏附作用发挥重要作用。MMPs是锌依赖的肽链内切酶[4]，在各种病理条件下，包括炎症性疾病[5,6]、肿瘤细胞的浸润[7]和血管生成[8]中所涉及的，可以降解ECM蛋白从而进行组织重塑的过程中[4,9]。在众多基质金属蛋白酶中，基质金属蛋白酶-9（Matrix metalloproteinase-9, MMP-9)在多种恶性肿瘤细胞中呈高表达，与肿瘤细胞的侵袭和转移能力密切相关[9,10]。另外，E-钙粘蛋白(E-Cadherin)通过粘附多种连环蛋白从而维持细胞间粘附作用的完整性，E-Cadherin的减少与肿瘤转移能力的增加密切相关。因此，寻找具有抑制其降解细胞外基质和减少粘附作用的潜能的药物是当前的热点。乌司他丁，作为尿激酶抑制剂（Ulinastatin, UTI）类似物，是一种在人的尿液和血液中发现的Kunutz型广谱丝氨酸酶蛋白酶抑制剂。乌司他丁能抑制多种丝氨酸酶，例如胰蛋白酶，胰凝乳蛋白酶，中性粒细胞弹性蛋白酶，血纤维蛋白溶酶和纤溶酶。基于广谱的蛋白酶抑制作用，乌司他丁被认为是一种天然的抗炎调节因子。在临床上，乌司他丁被广泛的应用于胰腺炎、急性循环障碍和围手术期血液稳定的调节等的治疗作用。除了其抗炎作用外，相关研究证实乌司他丁能够抑制通过抑制肿瘤细胞的EMT从而抑制了其侵袭和转移的能力[11]。我们前期的实验也证实，乌司他丁能够通过抑制MMP-9的表达从而抑制减少细胞外基质的降解进而抑制结肠癌细胞的侵袭和转移以及肝转移切除术后的复发[12]。姜黄素(Curcumin, CUR)是一种从草本植物姜黄的根茎中提取出来的酚类色素[13]。大量实验证明姜黄素能够通过调控特定的靶基因如转录因子、生长因子等从而抑制细胞的增殖、侵袭、转移和血管生成[14-17]。姜黄素可以通过抑制肿瘤细胞的EMT从而抑制肿瘤细胞的侵袭和转移[18]。姜黄素能够通过增加细胞粘附作用及E-cadherin的表达同时减少MMP-9的活性和表达从而抑制癌细胞的转移和侵袭[17]。本研究主要探讨乌司他丁和姜黄素二者联合作用是否能够更有效地抑制结直肠癌肝转移，为今后的临床治疗提出新的理论基础。研究目的1.通过体外实验分别观察乌司他丁和姜黄素对结直肠癌细胞增殖能力、转移能力、侵袭能力的影响，探讨乌司他丁和姜黄素抑制结直肠癌细胞增殖、转移和侵袭的作用机制。2.建立结直肠癌肝转移裸鼠模型，分别观察乌司他丁和姜黄素单独以及联合作用对结直肠癌肝转移裸鼠体内肿瘤转移情况的影响，为指导乌司他丁及姜黄素在预防结直肠癌肝转移的临床应用提供可靠的药理学依据，并提供有效的治疗手段及合理治疗方案。研究方法1.体外实验1.1实验分组：①生理盐水对照组；②乌司他丁组（UTI）组；③姜黄素组（CUR）组；④乌司他丁联合姜黄素（UTI+CUR）组。1.2CCK-8检测乌司他丁和姜黄素对结直肠癌细胞增殖的影响。1.3Wound healing细胞划痕实验检测乌司他丁和姜黄素对结直肠癌细胞转移能力的影响。1.4Transwell细胞体外侵袭实验检测乌司他丁和姜黄素对结直肠癌细胞侵袭能力的影响。1.5稳定表达luciferase和GFP的结直肠癌细胞株的构建，为体内实验做准备。2．体内实验2.1结肠癌肝转移模型的建立：选取慢病毒稳定感染的HCT-116结直肠癌细胞（HCT-116-Luc-GFP）制成细胞悬液，接种裸鼠脾脏被膜下，脾表面以75%乙醇棉棒压迫止血和杀灭可能外渗的癌细胞，防止腹腔内种植转移。将脾脏放回原位,关腹。2.2实验分组：裸鼠被随机分为4组。①生理盐水对照组：术后立即予生理盐水经腹腔注射，连续用药4周。②乌司他丁治疗组：术后立即予以乌司他丁（8000U/只）经腹腔注射，连续用药4周。③姜黄素治疗组：术后立即予以姜黄素（1g/kg）口服，连续用药4周。④乌司他丁联合姜黄素组：术后立即予以乌司他丁（8000U/只）经腹腔注射，同时予以姜黄素（1g/kg）口服，连续用药4周。2.3肿瘤体内转移检测：利用HCT-116-Luc-GFP结肠癌细胞表达的荧光素标记，利用生物活体成像技术观察结肠癌肝转移祼鼠模型肿瘤体内的转移情况。2.4免疫组化检测MMP-9和E-cadherin的表达情况。3．统计学处理所有数据均以均数±标准差表示，运用SPSS18.0软件进行统计学处理，计量资料用单因素方差分析，用Mann-Whitney U检比较组间的体视学定量分析，用LSD检验及进行组间均值比较进行组间均值比较。差异P<0.05具有统计学意义。研究结果1.乌司他丁和姜黄素抑制结肠癌细胞的增殖能力：CCK-8实验结果显示：在100~800U/ml的乌司他丁的处理之下对HCT-116细胞的增殖无明显抑制作用(p>0.05)，因此，我们使用800U/ml的乌司他丁作为后续实验的使用浓度。鉴于姜黄素对HCT-116细胞增殖的抑制作用，我们计算了其IC50值（抑制50%细胞生长时的浓度）为20μM。2.乌司他丁和姜黄素抑制结肠癌细胞体外迁移和侵袭能力的影响：①与生理盐水组对比，HCT-116经过乌司他丁、姜黄素处理后均能有效地抑制其迁移和侵袭（P<0.05）;②乌司他丁联合姜黄素作用于结直肠癌细胞其抑制迁移和侵袭能力比单独使用任一药物的作用均强。3．乌司他丁和姜黄素抑制结直肠癌肝转移同时延长了负荷瘤裸鼠的生存周期：裸鼠不管给予乌司他丁还是姜黄素与生理盐水组对比均明显地减少肝转移。同时，乌司他丁联合姜黄素治疗的裸鼠其肝转移抑制程度比单独使用任一药物的效果更明显。乌司他丁联合姜黄素治疗组其生存时间明显增加。7．免疫组化检测肝脏中转影响肿瘤内MMP-9和E-cadherin的表达情况：与对照组相比，MMP-9在UTI、CUR、UTI+CUR组中的表达明显减少，然而E-cadherin的表达明显增多。另外，乌司他丁联合姜黄素治疗组其抑制MMP-9的表达和增加E-cadherin的表达比单独使用任一药物的效果更明显结论1．乌司他丁和姜黄素均能体外抑制结直肠癌细胞的迁移和侵袭，且联合作用效果更强。2．乌司他丁和姜黄素均能抑制结直肠癌细胞肝转移并且能够延长负荷瘤裸鼠的生存周期，其两者联合作用效果更强，这可能与调节了E-cadherin表达升高和降低了MMP-9蛋白的表达相关。