目的 研究糖皮质激素对大鼠视网膜血管内皮细胞间紧密连接蛋白表达、分布及其功能的影响，从新的角度对糖皮质激素治疗黄斑水肿的药物作用机制进行探讨。 方法 一、大鼠视网膜血管内皮细胞分离与培养 (一)大鼠视网膜血管内皮细胞的分离纯化与原代培养 使用两种方法对大鼠视网膜血管内皮细胞进行分离纯化： 1.通过细胞贴壁时间不同对大鼠视网膜血管内皮细胞进行分离纯化。 自大鼠眼球中分离获得视网膜后，使用由含有10％胎牛血清的低糖型DMEM配制成的0.1％Ⅰ型胶原酶对视网膜进行消化60分钟，将消化产物通过75μm和50μm不锈钢细胞筛网过滤，收集滤液离心1000转/分钟，10分钟，去上清，加入培养基(含有20％胎牛血清，100U/ml青霉素，100μg/ml链霉素，100μg/ml血管内皮生长添加剂，10U/ml肝素的低糖型DMEM)吹打成细胞悬液，直接接种于培养板上，置37℃，5％CO2孵箱内孵育3小时后吸出培养液及未贴壁细胞，加入新鲜培养液继续培养。 2.使用CD31抗体包被的免疫磁珠对大鼠视网膜血管内皮细胞进行分离纯化 (1)制备磁珠 取包被有抗小鼠IgG1抗体的免疫磁珠50μl与20μl小鼠抗大鼠CD31抗体混合，置4℃过夜。使用前，用含有10％胎牛血清的低糖型DMEM洗涤3次，每次置磁珠分离器上15分钟，备用。 (2)分离细胞 将视网膜按前述方法进行处理，形成单细胞悬液，加入含有10％胎牛血清的低糖型DMEM漂洗一次，再次离心1000转/分钟，5分钟，去除上清，再加入含有10％胎牛血清的低糖型DMEM约2ml吹打成细胞悬液加入制备好的磁珠，室温，不断搅动下孵育一小时。将细胞悬液放置于磁珠分离器上8分钟，将试管内的液体吸出，洗涤6次。将得到的细胞加入培养基(含有20％胎牛血清，100U/ml青霉素，100μg/ml链霉素，100μg/ml血管内皮生长添加剂，10U/ml肝素的低糖型DMEM)吹打成细胞悬液，直接接种于使用纤维连接蛋白包被的培养板上，置37℃，5％CO2孵箱内培养。 (二)细胞传代： 使用0.25％胰蛋白酶对细胞单层进行消化，按1∶3进行传代。 (三)细胞鉴定： 观察细胞形态，并通过免疫荧光方法对细胞内vW因子表达进行检测。二、糖皮质激素对细胞间紧密连接的影响 取传至第四代到第六代视网膜血管内皮细胞，分为低糖组、低糖+地塞米松组、高糖组和高糖+地塞米松组，共四组，并接种于Millicell插入式细胞培养皿、预置盖玻片的24孔板和普通24孔板中，分别进行跨细胞电阻测定，紧密连接蛋白occludin、claudin-1和ZO-1的免疫荧光染色以及通过RT-PCR对claudin-1蛋白mRNA表达水平进行检测。通过预实验确定观察时间为6天。 (一)跨细胞电阻测量 将视网膜血管内皮细胞接种于Millicell插入式细胞培养皿，每日进行跨细胞电阻测量，评估紧密连接功能。设置1组未接种细胞的空白对照组，每孔每次测定3处电阻值，取其平均电阻值。每孔电阻值=每孔测定平均电阻值-空白对照孔测定平均电阻值。得到的各组数据使用SPSS11.5统计软件进行分析，规定P＜0.05时差别有显著性。 (二)紧密连接蛋白免疫荧光染色 将视网膜血管内皮细胞接种于预先放置盖玻片的24孔板中，加入不同成分的培养基后，取处理2、4及6天的视网膜血管内皮细胞进行紧密连接蛋白ZO-1、occludin和claudin-1的免疫荧光检测，观察紧密连接蛋白在细胞内的分布情况。 (三)RT-PCR检测claudin-1蛋白mRNA表达水平 将视网膜血管内皮细胞接种于普通24孔培养板中，加入四组不同的细胞培养基分别对细胞进行处理，取处理第2、4和6天细胞通过RT-PCR对紧密连接蛋白claudin-1的mRNA表达水平进行检测。PCR所用引物根据大鼠claudin-1mRNA序列，使用primer3软件进行设计，序列如下： claudin-1上游：5’aggtctggcgacattagtgg3’claudin-1下游：5’gaaggtgttggcttgggata3’PCR产物片段大小为228bp。 结果 一、大鼠视网膜血管内皮细胞培养 1.两种培养方法均可获得纯化的大鼠视网膜血管内皮细胞，光学纤维镜下细胞形态无明显差别。但是通过细胞贴壁时间不同对大鼠视网膜血管内皮细胞进行分离纯化的方法并不可靠，可重复性差。 2.培养得到的细胞通过形态学标准和免疫荧光鉴定，证实为血管内皮细胞。 二、糖皮质激素对细胞间紧密连接的影响 (一)跨细胞电阻测量 处理一天时各处理组间电阻值无显著差异。处理两天以上，加入地塞米松的两个处理组电阻值与未加入地塞米松的两个处理组电阻值之间有差异，通过原始数据可以看出前者均较后者高。但是加入地塞米松的两个处理组电阻值之间和未加入地塞米松的两个处理组电阻值之间未见明显差异。通过对相同处理组间，不同处理时间各电阻值进行比较，可以发现使用地塞米松处理细胞2天后电阻值既可升高并趋于稳定。 (二)紧密连接蛋白免疫荧光染色 紧密连接蛋白occludin、claudin-1和ZO-1均表达于视网膜血管内皮细胞的胞浆中。低糖组与高糖组细胞紧密连接蛋白的分布未见明显差异，使用含有地塞米松培养液处理的两组细胞间紧密连接蛋白分布可见向细胞浆的外周聚集。 (三)RT-PCR检测claudin-1蛋白mRNA表达水平 使用含有地塞米松培养液培养的两组细胞间紧密连接蛋白claudin-1mRNA表达水平，均较使用不含地塞米松培养液培养的两组细胞升高，培养6天时尤其明显。 结论 1.使用CD31抗体包被的免疫磁珠对大鼠视网膜血管内皮细胞进行分离纯化较根据细胞贴壁速度不同对其进行纯化的方法可靠，可重复性较好。 2.糖皮质激素可以使体外培养的大鼠视网膜血管内皮细胞跨细胞电阻升高、紧密连接蛋白重分布并使紧密连接蛋白claudin-1的mRNA表达水平升高。 3.在6天的观察期内，较低糖型DMEM而言，高糖型DMEM未引起紧密连接功能、蛋白分布以及mRNA表达水平的明显变化。