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第一部分FEAT蛋白在乳腺癌组织中的表达及其临床病理意义目的FEAT蛋白为METTL13基因所编码的蛋白,其一致的过表达于多种人类癌组织,但是在正常组织却表达较弱。FEAT蛋白具有抗凋亡活性,在致癌过程中发挥重要作用。然而,在恶性肿瘤中FEAT蛋白和临床病理特征的相关性未见报道。为此,我们在乳腺癌中进行了 FEAT蛋白的表达与临床病理特征之间相关性及其临床意义的研究。方法采用免疫组化方法检测131例乳腺癌组织FEAT蛋白的表达情况,进一步分析FEAT蛋白表达与临床病理特征的相关性。同时我们也进行了乳腺癌组织和正常乳腺组织之间FEAT蛋白表达差异的分析。随后,我们分析了 FEAT蛋白表达对乳腺癌患者的总生存时间(OS,overall survival)及无病生存时间(DFS,disease-free survival)的影响。结果免疫组化结果显示,FEAT蛋白表达于乳腺癌组织及正常乳腺组织的胞浆中。相比于正常乳腺组织,FEAT蛋白在乳腺癌组织中显著高表达(P<0.05)。与肿块较小(≤2 cm)、PR阳性、HER2阴性、低Ki67指数(<14%)的乳腺癌组织相比,FEAT蛋白明显高表达于肿块较大(>2cm)、PR阴性、HER2阳性、高Ki67指数(≥14%)的乳腺癌组织中(P<0.05)。另外,FEAT蛋白的表达与肿块大小、PR状态、HER2表达、Ki67指数及分子分型之间存在明显相关性。生存分析显示,与FEAT低表达的乳腺癌患者相比,FEAT高表达乳腺癌患者的DFS及OS明显缩短(P<0.05)。多元COX回归分析表明,FEAT蛋白的表达水平是乳腺癌患者的独立复发风险因素,但不是乳腺癌患者的独立生存风险因素。结论FEAT蛋白在乳腺癌组织中呈高表达,并且与乳腺癌的临床病理特征存在相关性,为乳腺癌的独立复发风险因素。因此,FEAT可能是潜在的预测乳腺癌复发的生物标志物。第二部分FEAT蛋白对MCF-7细胞生物学行为的影响目的检测乳腺癌细胞株MCF-7中FEAT蛋白的表达。沉默MCF-7细胞中METTL13基因的表达后,观察MCF-7细胞生长、迁移、周期及凋亡的变化。方法设计3条干扰FEAT表达的siRNA用于沉默MCF-7细胞中METTL13基因表达,分设 5 组,NC 组、MOCK 组、FEATsiRNAl 组、FEAT2siRNA2 组及 FEAT siRNA3组,运用实时荧光定量PCR(qPCR)及Western-blot验证基因沉默效果。选用沉默效果最佳的一条FEAT siRNA进行下一步实验,将MCF-7细胞分为3组,NC组、MOCK组及siRNAFEAT组。运用MTT法检测3组细胞的增殖能力。采用平板克隆实验检测3组细胞克隆形成率。运用划痕实验观察3组细胞划痕愈合率。Transwell实验检测3组细胞培养24h后穿膜细胞数。运用PI染色法检测3组细胞转染48h后的细胞周期分布。运用FITC Annexin V-PI双染法检测3组细胞转染48h及72h后的细胞凋亡率。结果转染 24h 后,NC 组、MOCK 组、FEAT siRNA1 组、FEATsiRNA2 组及FEATsiRNA3组METTL13m N 的表达水平分别为 1、0.903±0.173、0.175±0.076、0.196±0.034 及 0.330±0.091,FEATsiRNA1 组、FEATsiRNA2 组及 FEATsiRNA3 组METTL13mRNA的表达水平显著低于NC组及MOCK组(P=0.000)。转染48h后,NC 组、MOCK 组、FEATsiRNA1 组、FEATsiRNA2 组及 FEATsiRNA3 组 FEAT 蛋白相对表达量分别为:1,1.1127±0.1128,0.2513±0.0432,0.7167±0.0759,0.628±0.0548,FEATsiRNA1 组、FEATsiRNA2 组及 FEATsiRNA3 组 FEAT 蛋白表达水平显著低于NC组及MOCK组(P=0.000)。MTT增殖实验显示3组细胞培养24h及48h后,siRNAFEAT组OD值均低于NC组及MOCK组,但3组之间OD值差异无统计学意义(P=0.098);72h及96h后,siRNA FEAT组OD值显著低于NC组及MOCK组,差异具有统计学意义(P=0.000)。平板克隆形成实验显示,NC组、MOCK组及siRNAFEAT组细胞的克隆形成率分别为:26.22%±1.89%、26.67%±2.19%、7.45%±0.69%,siRNAFEAT 组显著低于 NC 组及 MOCK(P<0.05)。划痕实验显示,划痕24h后NC组、MOCK组及siRNAFEAT组细胞划痕愈合率分别为:53.63±6.66%,56.74±3.71%及 37.50±6.15%;划痕 48h 后 NC 组、MOCK 组及siRNAFEAT组细胞划痕愈合率分别为:100.00±0.00%,100.000±0.00%及62.06±5.11%,siRNAFEAT组愈合率均显著低于NC组及MOCK组(P<0.05)。Transwell实验显示,细胞接种于transwell小室24h后,NC组、MOCK组及siRNAFEAT组的穿膜细胞数分别为 267.67±27.46、255.33±56.20 及46.33±21.27,siRNAFEAT组穿膜细胞数显著低于NC组及MOCK组(P<0.05)。PI染色法显示,细胞转染48h后,NC组细胞的细胞周期分布为:G1期占66.43±3.85%、S期占26.40±3.62%、G2/M期占7.17±0.55%;MOCK组细胞的细胞周期分布为:G1期占65.49±1.25%、S 期占 27.51±1.11%、G2/M 期占 6.70±0.23%;siRNA FEAT 组细胞的细胞周期分布为:G1期占82.63±1.62%、S期占11.37±1.70%、G2/M期占6.01±0.49%;siRNA FEAT组细胞的G1期细胞比例明显高于NC组及MOCK组(P<0.05),而S期细胞比例下降(P<0.05)。FITCAnnexinV-PI双染法显示转染48h后NC组、MOCK组及siRNA FEAT细胞的凋亡率分别为5.80±1.23%、5.37±0.86%及6.63±1.07%,3组之间差异无统计学意义CP>0.05);转染72h后NC组、MOCK组及siRNA FEAT组细胞的凋亡率分别为6.07±0.60%、6.03±0.90%及5.90±1.14%,3组之间差异也无统计学意义(P>0.05)。结论FEATsiRNA可下调乳腺癌细胞株MCF-7中METTL13基因的表达,进而导致MCF-7细胞中FEAT蛋白表达下降。FEAT蛋白表达下降后可抑制MCF-7细胞增殖,同时MCF-7细胞迁移能力下降,且使得MCF-7细胞细胞阻滞于G1期而导致其增殖能力下降。但FEAT蛋白表达下降后对细胞凋亡无明显影响。第三部分FEAT蛋白对MCF-7细胞药物敏感性及蛋白表达的影响目的MCF-7细胞中FEAT蛋白表达下降后,观察MCF-7细胞对紫杉醇、表柔比星及环磷酰胺药物敏感性的变化,并观察FEAT蛋白表达下调与3种药物对细胞凋亡及杀伤的联合效应。观察FEAT蛋白表达下降后对凋亡及周期相关蛋白表达的影响。方法将MCF-7细胞分为2组,NC组及siRNAFEAT组,以不同浓度的环磷酰胺(0mg/L、100mg/L、200mg/L、400mg/L、800mg/L 及 1600mg/L)、表柔比星(0μM、0.2μM、1μM、5μM、25μM、125μM 或紫杉醇(0、0.08μM、0.4μM、2μM、10μM及50μM)分别作用2组细胞48h后,MTT法检测2组细胞的吸光值,分别计算环磷酰胺、表柔比星及紫杉醇在2组细胞中的IC50值。以800mg/L环磷酰胺、1.5μM表柔比星及4.5μM紫杉醇作用NC组及siRNAFEAT组细胞36h后,FITC Annexin V-PI双染法检测2组细胞的细胞凋亡及坏死情况。将MCF-7细胞分为3组,NC组、MOCK组及siRNA FEAT组,转染48h后提取总蛋白,测定蛋白浓度,运用免疫印迹法测定3组细胞之间Caspase-3、p21、AKT、p-AKT及CDK2蛋白的表达差异。结果NC组及siRNAFEAT组环磷酰胺的IC50值分别为1446.43±9.82mg/L及999.56±139.43mg/L。NC组及siRNAFEAT组表柔比星的IC50值分别为2.25±0.17μM 及 1.04±0.28μM。NC 组及 siRNAFEAT 组紫杉醇的 IC50 值分别为40.47±14.23μM 及 10.36±5.02μM;3 个药物在 siRNAFEAT 组的 IC50 值均显著低于NC组(P<0.05)。以800mg/L环磷酰胺作用NC组及siRNAFEAT组细胞36h后,2组细胞的细胞坏死比例分别为:6.07%±1.86及45.23%±5.45,以1.5μM表柔比星作用NC组及siRNAFEAT组细胞36h后,2组细胞的细胞坏死比例分别为:6.77%±2.72 及 53.60%±3.87,以 4.5μM 紫杉醇作用 NC 组及 siRNAFEAT 组细胞 36h后,2组细胞的细胞坏死比例分别为:7.13%±1.32及49.67%±2.98;3个药物在siRNAFEAT组的细胞坏死比例均显著高于NC组(P<0.05)。3组细胞之间Caspase-3、AKT、p-AKT、及CDK2蛋白表达无明显差异,而siRNAFEAT组中p21蛋白的表达明显高于NC组及MOCK组(P<0.05)。结论FEAT蛋白表达下降后可增加MCF-7细胞对紫杉醇、表柔比星及环磷酰胺的敏感性,可增强紫杉醇、表柔比星及环磷酰胺对MCF-7细胞的杀伤作用。FEAT蛋白表达下降后可通过上调MCF-7细胞中p21蛋白的表达而影响细胞周期。