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第一部分Survivin基因在TCCB患者组织和尿脱落细胞中的表达及其临床意义目的:检测Survivin基因在膀胱移行细胞癌(TCCB)患者癌组织与尿脱落细胞中的表达情况,并探讨二者的相关性及其临床意义。方法:48例标本来自武汉同济医院2004年9月～2006年9月期间所有病理证实为TCCB,其中男35例,女13例,年龄56.4+2.6岁,I级7例、II级30例、III级11例,Tis~T1期40例和T2~T4期8例;初发患者30例,复发18例。分别采用巢式逆转录聚合酶链反应(Nested RT-PCR)法检测48例TCCB和16例非TCCB对照组(其中8例腺性膀胱炎、5例BPH、3例膀胱结核患者)组织及尿脱落细胞中Survivin mRNA表达情况。采用免疫组织化学SP法复检所有TCCB患者癌组织Survivin蛋白的表达情况并确定其临床病理分期和分级。统计学方法分析了Survivin表达与TCCB的分期分级及预后等病理学参数之间的关系。结果:48例TCCB患者癌组织中Survivin基因的阳性表达率为(36/48)75.0%,mRNA表达结果与蛋白免疫组织化学结果一致。在尿液中的mRNA阳性表达率为(34/48)70.8%;16例非TCCB组织中Survivin基因的阳性表达率仅为(1/16)6.3%而尿液中未见Survivin基因表达。以上表明Survivin基因在TCCB组织中的表达显著高于非肿瘤组织中的表达(P<0.01);而组织标本与尿液标本对Survivin基因的检出率无明显差异(P>0.05)。Survivin基因在TCCB患者中呈不同程度的表达,其表达随TCCB的病理分级、临床分期的增高而相应增高,复发TCCB表达明显增高。I、II、III级阳性表达率分别为55.6%,76.7%,88.9%;浅表性(Tis~T1)、浸润性(T2~T4)中阳性表达率分别为72.5%和87.5%;初发及复发TCCB阳性表达率为65.5%和89.5% (P<0.01)。Survivin的阳性表达与膀胱癌的病理分级分期或是否复发关系密切(P<0.05),而与患者年龄、性别、肿瘤大小或生长方式无明显相关性(P>0.05)。结论:细胞凋亡抑制因子Survivin在TCCB组织中表达上调,且表达水平与TCCB分级分期及复发正相关,提示Survivin基因可能通过抑制细胞凋亡在TCCB的发生发展和肿瘤转移及预后等方面起重要作用,而检测尿脱落细胞中Survivin表达可作为TCCB的筛查、早期诊断、术后监测的新方法,膀胱肿瘤细胞中Survivin基因也可能为生物学治疗提供新的靶点。第二部分Survivin反义寡核苷酸诱导膀胱癌细胞凋亡及增强其化疗敏感性目的:探讨Survivin反义寡核苷酸(Survivin-ASODN)对化疗药丝裂霉素C(MMC)诱导膀胱癌T24细胞凋亡的影响。方法:将已构建成功的Survivin-ASODN真核表达载体pcDNA3-SVVas通过脂质体介导转染膀胱癌细胞系T24,并筛选转染成功的阳性克隆;采用RT-PCR法检测其Survivin mRNA的表达;台盼蓝拒染法观察Survivin-ASODN与MMC联合应用对癌细胞生存的影响;细胞计数和MTT试验测定MMC对转染细胞增殖抑制情况;琼脂糖凝胶电泳分析凋亡细胞DNA断裂情况;核染色检测凋亡细胞的细胞核变化;流式细胞术检测细胞凋亡率。结果:转染Survivin-ASODN真核表达载体pcDNA3-SVVas的T24-SVVas细胞Survivin mRNA表达水平下降、细胞增殖明显受抑,与转染pcDNA3空载体T24-neo细胞及未转染载体的T24细胞进行比较,具有显著性差异(P<0.05);经琼脂糖凝胶电泳,T24-SVVas细胞组均可见到DNA梯形条带,而其他对照组未发现;与对照组细胞相比,转染阳性克隆细胞的细胞核呈致密浓染;加入MMC的T24-SVVas细胞凋亡率大幅度增加(P<0.05)。结论:Survivin-ASODN可促进MMC诱导膀胱癌细胞凋亡及增加其对化疗药物的敏感性,为膀胱癌的生物学治疗研究奠定了实验基础。第三部分siRNA靶向Survivin对膀胱癌细胞增殖与凋亡的影响目的:采用RNA干扰技术(siRNA )阻断Survivin基因的表达,观察其抑制膀胱癌细胞T24增殖及诱导细胞凋亡的作用。方法:本研究使用的pGenesil-1-SVVsi质粒含有U6启动子、EGFP标记蛋白和三条针对Survivin基因的siRNA表达载体,采用LipofectamineTM2000转染至人膀胱癌细胞系T24,并筛选转染成功的阳性克隆(T24-SVVsi);同时设置空载体(T24-neo)和未转染T24作为对照组,采用RT-PCR、Westernblot技术检测各组肿瘤细胞Survivin的mRNA和蛋白表达变化;采用MTT法和聚落形成试验检测对T24细胞增殖抑制作用;透射电镜观察凋亡细胞形态变化;采用Annexin-V/PI双色标记的流式细胞术(FCM)检测Survivin-siRNA诱导的细胞凋亡情况;并采用MTT测定转染的T24细胞对化疗药物MMC的敏感性。结果:透射电镜下可观察到转染组凋亡的征象,而各对照组未见凋亡证据;肿瘤细胞的转染组Survivin的mRNA和蛋白质表达降低至少50%;T24细胞接种48 h后其增殖抑制率达47%;FCM分析显示转染组细胞均阻滞在G2/M期,细胞复制时间延长1.4倍,凋亡率(AR)明显增加,由3.38%增加到33.86%。具有显著意义(P<0.05)。MTT试验显示,与对照组比较,细胞转染组MMC对肿瘤半数抑制浓度(IC50)明显降低(P<0.05)。结论:靶向Survivin基因的重组siRNA载体pGenesil1-SVVsi有效抑制了Survivin基因表达,可显著抑制T24细胞增殖并在一定程度上诱导其凋亡,并能更有效增强化疗药物的敏感性。这表明据抗Survivin的RNA干扰技术在膀胱癌的基因治疗中具有重要价值。第四部分Survivin-siRNA靶向复合物系统治疗TCCB的实验研究目的:制备含有Survivin-siRNA双表达载体和靶向分子TfRscFv-GAL4的复合物系统,并研究该靶向复合物系统(TfRScFv-GAL4-GAL4rec-SurvivinsiRNA -pGes)对膀胱癌细胞系T24的生物学效应。方法:①以摩尔比为1:2.5的比例将GAL4rec-SurvivinsiRNA- pGes和TfRScFv-GAL4在体外混合,并以4.5%非变性的聚丙烯凝胶电泳检测制备的靶向复合物系统;②流式细胞仪检测在靶细胞内绿色荧光蛋白表达率;③倒置荧光显微镜观察TfRScFv-GAL4介导的靶向复合物内吞作用及目的基因的表达;④采用萤光定量RT-PCR和Western-blot分别检测阳性表达细胞Survivin mRNA和蛋白的变化;⑤MTT法检测靶向复合物系统对不同组细胞增殖抑制情况;⑥靶向复合物系统与膀胱癌细胞株T24共孵育48h后,Hochest染细胞核观察细胞凋亡现象;⑦Annexin-V/PI双色标记的流式细胞术分析靶向复合物系统对不同组细胞周期的影响结果:①凝胶电泳中可见TfRScFv蛋白加入不同浓度GAL4rec-SurvivinsiRNA-pGes载体,蛋白染色只有一条条带;而GAL4蛋白和TfRScFv-GAL4蛋白随加入的GAL4rec-SurvivinsiRNA-pGes载体量的增加,向上移位的蛋白增多,表明TfRscFv-GAL4融合蛋白可通过其中GAL4片断与GAL4rec-SurvivinsiRNA-pGes载体特异性连接,并在最适摩尔比例为1:2.5条件下成功制备TfRScFv-GAL4-GAL4rec-SurvivinsiRNA-pGes靶向复合物系统;②FCM检测表明靶向复合物系统在靶细胞内绿色荧光蛋白表达率为44.30%。③靶向复合物系统与肿瘤细胞共孵育后,在荧光显微镜下可见细胞内有绿色荧光蛋白表达,而其他各实验对照组均未见细胞内有绿色荧光蛋白表达。在光镜下可见靶向复合物系统组有部分贴壁细胞胞质回缩,胞体趋于变圆,似凋亡细胞的形态,而其他各实验组细胞贴壁,生长良好;④萤光定量RT-PCR和West-blotting检测显示,靶向复合物系统组Survivin mRNA和蛋白表达量降低至少53%;⑤MTT检测表明靶向复合物系统组肿瘤细胞生长明显抑制(P<0.05);⑥Hochest染色可见,靶向复合物系统组可见大量的凋亡细胞,而其他组凋亡细胞较少,叠加照片显示光镜中所见胞质回缩,胞体趋于变圆的细胞,均为凋亡的细胞;⑦双色标记的流式细胞术检测结果显示,靶向复合物系统组肿瘤细胞周期阻滞在G2/M期,凋亡率明显增加(P<0.05)。结论:①靶向复合物系统TfRscFv-GAL4-GAL4rec-SurvivinsiRNA-pGes与肿瘤细胞孵育后能被内吞进入细胞内表达绿色荧光蛋白,并诱导肿瘤细胞凋亡。表明TfRscFv-GAL4具有较好的肿瘤靶向性,并能介导双基因表达载体在肿瘤细胞中的表达。②靶向复合物系统表达的Survivin-siRNA能有效抑制膀胱癌细胞增殖并诱导细胞凋亡,对正常细胞无影响。