论文部分内容阅读
猪圆环病毒(Porcinecircorirus，PCV)是迄今为止发现的一种最小的动物病毒，其基因组为单股环状DNA，病毒粒子无囊膜，呈二十面体对称。PCV可划分为PCV1和PCV2两种基因型，其中PCV1基因组全长1759bp，无致病性，但广泛存在于猪体和猪源细胞系，首先由Tischer于PK-15细胞中发现；PCV2基因组长1767bp或1768bp，被认为是仔猪断奶后多系统衰竭综合征(Postweaningmultisystemicwastingsyndrome，PMWS)的主要病原。PCV2有两个主要的开放阅读框(ORF)：ORF1和ORF2，ORF2基因编码该病毒的结构蛋白，是区分PCV1和PCV2的重要区域。我国于2000年首次发现了PCV2的存在，该病毒在我国猪场中感染率高，猪群的平均阳性率一般都大于20％，有的甚至超过50％，有些地区高达100％，可以说目前该病毒已在我国猪群中普遍存在，每年因PCV2感染造成经济损失达数亿元。
为了构建PCV2CAP基因重组禽痘病毒，将其亚克隆到含有LP2EFP2早晚期启动子的载体pSY538的BamHI何点，将带有痘曲病毒启动子P11的LacZ基因平端克隆到质粒pSY681的SfiⅠ位点，然后切下含有LP2EP2启动子的CAP片段再亚克隆到禽痘病毒载体pSY681的NotⅠ位点，用脂质体将其转染已感染亲本禽痘病毒S-FPV-017株的鸡胚成纤维细胞，在含有x-gal的营养琼脂培养基上进行蓝斑筛选，获得重组病毒rFPV-CAP，通过PCR和酶切进行鉴定。结果表明获得包含有PCV2CAP基因的禽痘病毒并且具有稳定的遗传性状。以间接免疫荧光法证实感染rFPV-CAP的CEF中存在表达的CAP蛋白，为研发PCV2病毒重组禽痘病毒疫苗奠定了基础。
共表达PCV2CAP基因与猪IL-18基因的重组禽痘病毒的构建，将含有LP2EP2启动子的IL-18基因克隆至含有CAP基因的重组禽痘病毒rFPV-S1的上游，用脂质体将其转染已感染亲本禽痘病毒S-FPV-017株的鸡胚成纤维细胞，在含有x-gal的营养琼脂培养基上进行蓝斑筛选，获得重组病毒rFPV-CAP-IL-18，通过PCR和酶切进行鉴定。结果表明获得包含有PCV2CAP基因和IL-18的重组禽痘病毒并且具有稳定的遗传性状。以间接免疫荧光法证实感染rFPV-CAP-IL-18的CEF中存在表达的CAP蛋白。为开发利用IL-18的佐剂效应及构建共表达IL-18基因和保护性抗原基因的重组禽痘病毒疫苗奠定基础。
本研究成功获得了PCV2CAP基因全序列；成功获得了重组禽痘病毒rFPV-cAP并能在CEF中进行真实表达。成功获得了重组禽痘病毒rFPV-CAP-IL-18。为开发利用IL-18的佐剂效应及构建共表达IL-18基因和保护性抗原基因的重组禽痘病毒疫苗奠定基础。