猪δ冠状病毒（Porcine Deltacoronavirus,PDCo V）是一种有包膜的单链正义RNA病毒,属于冠状病毒科下δ冠状病毒属的成员。PDCo V感染的主要症状是急性呕吐、严重腹泻和消瘦,严重消瘦大大增加了哺乳仔猪的淘汰率及死亡率,因此对仔猪危害尤为严重。目前为止,PDCo V已在包括中国、美国、加拿大、泰国和韩国等多个国家暴发与流行,同时给全球养猪业造成了巨大经济损失,但对PDCo V导致仔猪严重腹泻的致病机理及分子机制知之甚少。溶质载体家族9亚家族A成员3（Solute carrier family 9 subfamily A member 3,SLC9A3）属于溶质载体家族,是编码钠氢交换器3（Sodium-hydrogen exchanger member 3,NHE3）的核心基因,NHE3是小肠表面上皮细胞顶膜上参与Na+/H+交换的主要转运载体,当NHE3活性长期处于抑制状态时,会引起腹泻甚至导致死亡。本实验室前期利用PDCo V CHN-GD16-05分离株对2日龄仔猪进行攻毒试验,取肠道组织样品送到相关公司进行转录组学高通量测序,对部分结果进行软件分析并绘制可视化关系网络图。结果表明表达差异且具有生物学意义的mi RNA-m RNA调控主要富集在消化系统的蛋白质消化信号通路上,相关基因m RNA显著下调,相关mi RNA显著上调,其中SLC9A3基因具有最高富集度。本研究以PDCo V为研究对象,探索PDCo V感染IPI-2I细胞对候选mi RNAs、SLC9A3基因和NHE3蛋白的表达以及NHE3活性之间的关系。首先通过对IPEC-J2细胞进行胰酶耐受度测试、最佳感染复数筛选及不同猪源细胞系病毒感染能力测试,成功利用IPI-2I细胞建立PDCo V体外研究细胞模型。为验证高通量测序结果可信度,收取病毒感染不同时间点细胞裂解液,q RT-PCR检测结果显示关联网络图中涉及的10个基因m RNAs及12个mi RNAs均能够在PDCo V感染细胞后发生差异性表达,表明前期试验高通量测序结果真实可信。接着本研究探究SLC9A3/NHE3功能。为验证PDCo V感染IPI-2I细胞后影响SLC9A3基因和NHE3蛋白的表达及NHE3活性,收取病毒感染不同时间点样品进行q RT-PCR、western blotting和NHE3活性检测,结果显示SLC9A3基因表达下调、NHE3蛋白表达下调和NHE3活性下调,表明PDCo V感染能够抑制NHE3活性。为验证SLC9A3基因表达影响NHE3蛋白表达及NHE3活性,对SLC9A3基因进行过/失表达,结果表明SLC9A3基因正向调控NHE3蛋白表达和NHE3活性。使用在线靶基因预测软件将与SLC9A3基因有关系的7个mi RNAs筛选后,预测出4个与SLC9A3基因可能有靶向结合的候选mi RNAs（ssc-mi R-133a-3p、ssc-mi R-326、ssc-mi R-338、ssc-mi R-361-3p）。为探究各候选mi RNAs对SLC9A3/NHE3的影响,使用mi RNA mimics/inhibitors对mi RNA进行过/失表达,q RT-PCR和western blotting检测显示各候选mi RNAs均能不同程度负调控SLC9A3基因及NHE3蛋白的表达。通过双荧光素酶活性验证试验确定ssc-mi R-361-3p与SLC9A3基因之间存在靶向结合关系,同时转染ssc-mi R-361-3p mimics能够使NHE3活性下调,而转染ssc-mi R-361-3p inhibitors可以使NHE3活性上调,表明SLC9A3基因是ssc-mi R-361-3p的靶向基因,且ssc-mi R-361-3p负调控NHE3活性。最后通过对细胞抑制ssc-mi R-361-3p并感染PDCo V后检测NHE3活性,结果显示与对照组无显著差异,表明ssc-mi R-361-3p inhibitors逆转了PDCo V对NHE3活性的抑制作用。综上所述,本研究证实PDCo V通过mi R-361-3p-SLC9A3调控轴对IPI-2I细胞NHE3活性起抑制作用,为解析PDCo V导致仔猪严重腹泻的致病机理提供理论依据。