论文部分内容阅读
背景临床上慢性乙型肝炎病毒(Hepatitis B virus,HBV)感染患者,多需要较长期治疗,甚至可能需要终身的抗病毒治疗。抗HBV核苷(酸)类药均经过肾脏代谢,关于肾功能异常或有潜在肾功能异常高危的慢性乙型病毒性肝炎患者,筛选出对肾脏可能有保护作用的药物显得非常重要。多项研究显示:替比夫定(Telbivudine,L-DT)在抗病毒的同时具备持续的改善慢性HBV感染患者的肾功能的作用,具体机制不清。目的通过对不同浓度的L-DT对人肾小球足细胞(Human podocyte cells,HPC)的增殖的影响,了解L-DT在细胞增殖层面对HPC的影响,然后根据细胞增殖层面上了解最佳的研究浓度后,在细胞因子层次研究其对血管内皮生长因子(Vascular endothelial growth factor,VEGF)m RNA在表达量的影响,为L-DT呈现的肾功能保护作用的可能机制提供一定的实验基础。方法以HPC为研究对象,在体外经消化、传代细胞的培养后,选对数生长期进行实验,以不含L-DT药物(L-DT 0 mmol/L)的空白组为对照组,和6个不同浓度梯度(L-DT 10、20、40、60、100、150mmol/L)为实验组,以5000/孔的细胞密度接种在事先消毒好的96孔板中,体积100ul/孔,培养待细胞接触面积达80%后吸去培养液,再饥饿24h后,每孔中加入等体积制备好的各实验组浓度,分别对作用24、48、72h后的细胞通过倒置显微镜来察看细胞形态和4-甲基偶氮唑蓝(Methylthiazolyl Tetrazolium,MTT)法检测细胞的活力,了解L-DT对HPC增殖的影响。并计算出L-DT对HPC增殖的半数抑制药物浓度(Half maximal inhibitory concentration,IC50)。根据IC50设定RT-PCR所需的三个具有代表意义的浓度的(L-DT10、50、100mmol/L)与空白对照组相比来反应L-DT对HPC的VEGF mRNA表达量的影响。将半定量RT-PCR产物进行凝胶电泳成像,同时采取GAPDH为内参,用相关软件对各条带的灰度值进行检测对比,用VEGF/GAPDH灰度值的比值进行描述VEGFmRNA的表达量。本实验使用SPSS 21.0统计软件进行相关数据分析,采取的计量资料用均数±标准差(x±s)表示,各组间的比较用ANOVA方差分析(选择Levene检验法检测方差齐性检验),P<0.05为差异有统计学意义。结果细胞形态的变化:通过倒置显微镜可以观察到细胞形状随药物浓度增加及作用时间的延长逐步呈现细胞核的浓缩,甚至呈现胞质空泡。MTT细胞活力检测:当100mmol/L的药物浓度作用24、48、72h后细胞抑制率分别为(40.85±1.37)%、(51.03±2.15)%、(76.11±4.36)%,各组间的差异具有统计学意义(P<0.05);L-DT作用HPC的IC50为100 mmol/L培养48h;不同的浓度和不同的作用时间对HPC的抑制率之间均有差异,且差异均有统计学意义(P<0.05)。半定量RT-PCR结果显示,L-DT10、50、100mmol/L三组实验组与空白对照组相比均下调VEGFmRNA的表达量(P<0.05),且100mmol/L的高剂量组对VEGFmRNA表达的抑制作用更明显(P<0.05)。结论1.L-DT对HPC的增殖有抑制作用,且呈时间和剂量的依赖性。2.L-DT下调了VEGFmRNA的表达。3.L-DT可能是通过抑制患者HPC的VEGFm RNA的表达,参与肾脏保护作用机制。