随着创新药物研发进程的不断加深,常规药物靶点的开发已趋于饱和。这对新药研发造成了巨大的阻碍,导致一些疾病已经出现了无药可用的困境。常规的膜蛋白药物靶点主要集中在胞内区、胞外区或膜蛋白内腔,而跨膜域因为通常具有结构不明确和高度疏水等特点,普遍被认为是难以成药的。为了扩充新的药物靶点,本论文将关注点集中在极具挑战性的跨膜结构域蛋白-蛋白相互作用界面上。潜伏膜蛋白1（LMP-1）作为Epstein-Barr（EB）病毒的致癌蛋白,是一个六次跨膜蛋白。其跨膜域在脂筏上寡聚化会引发下游相关信号通路的激活,从而导致癌细胞的转移和永生化。前期研究已经揭示了 LMP-1的第五跨膜结构域（TMD5）是导致LMP-1寡聚化的关键因素,但是其作用机制尚不明确。因此,本论文以EB病毒LMP-1的第五跨膜域为对象研究跨膜结构域的寡聚化机制,并在此基础上以膜蛋白跨膜结构域为靶点开展了靶向跨膜蛋白-蛋白相互作用（PPIs）的调节剂发现研究。具体研究内容如下:1.通过计算模拟和wet-lab实验研究TMD5第150位点的天冬氨酸D150如何调控TMD5的寡聚化。研究结果表明D150质子化可稳定TMD5三聚体的存在,而非质子化的D150会导致TMD5在膜中产生弯曲,从而扰动三聚体的稳定结构。D150突变实验进一步证明了 D150的质子化对TMD5三聚化的重要性。鉴于D150对于TMD5三聚化的重要作用,靶向D150或保留D150可以分别作为设计靶向跨膜域寡聚化的小分子或多肽探针的初始原则。2.鉴于质子化的D150具有一定的亲水性,不利于单体TMD5在膜中的稳定存在,而三聚化的TMD5必须由质子化的D150维持,因此三聚化的过程中必然存在D150质子化状态的改变。因此,我们通过分子动力学模拟和恒定pH分子动力学模拟进一步研究了 TMD5三聚化过程中D150的pKa变化。研究发现相对于在水溶液中,D150的pKa在膜环境中会趋向7（中性pH）。当TMD5为单体时,脂质双层膜的微环境是影响其pKa变化的主要因素,但当TMD5相互靠近时,PPIs就变成了影响其pKa的主要因素。本部分阐明了 TMD5螺旋在其寡聚化过程中的行为以及D150的pKa随TMD5三聚化的变化过程,从原子层面表明了 D150如何通过质子化状态的改变调控TMD5三聚化的动态过程。因此,D150可以作为TMD5寡聚化调节剂的关键作用残基进行先导化合物的发现研究。3.基于以上LMP-1的TMD5寡聚机制及小分子抑制剂的前期筛选研究,本部分设计并合成了一系列pentamidine（潘他密汀）类似物,通过生物活性测试发现化合物2的IC50为0.6±0.3 μM,相对于先导化合物pentamidine（IC50=9.1 ±0.6 μM）其活性提高了约15倍。分子动力学模拟研究从原子层面阐明了小分子化合物与TMD5相互作用的机制:化合物是以一端脒基与D150作用,而另一端脒基与脂质极性头部基团相互作用的方式来抑制TMD5寡聚化的。Linker长度为7个原子,且linker类型为二酰胺的化合物不仅不会导致TMD5螺旋在膜中弯曲,还具备优良的膜渗透性,因而更易与TMD5结合。这项研究为合理设计靶向跨膜PPIs的小分子抑制剂提供了范例。4.鉴于有机小分子通常存在毒性大、代谢快以及靶向性差等缺陷,我们进一步进行了多肽抑制剂的设计。鉴于D150对LMP-1的TMD5寡聚化具有重要作用,利用Rosetta理性设计了保留关键残基D150并可与TMD5寡聚化的多肽anti-TMD5。研究发现一分子anti-TMD5与两分子野生型TMD5形成的异源三聚体较TMD5同源三聚体更加稳定,具备破坏TMD5三聚化的潜力。随后通过生物物理测试和细胞实验发现其不但破坏TMD5三聚体结构,还可抑制EB病毒阳性淋巴瘤细胞LMP-1寡聚化诱导的NF-κB活性,表明anti-TMD5可抑制全长LMP-1的寡聚化。综上所述,本论文针对传统认为难以成药的跨膜结构域蛋白-蛋白相互作用界面,选取LMP-1的第五跨膜结构域作为研究对象,通过计算模拟从原子层面阐明了关键残基D150的特性和其对寡聚化的影响,以及TMD5螺旋在寡聚化过程中的行为和寡聚化机制,并在此指导下设计评估了理性设计的小分子抑制剂和多肽抑制剂的作用效果,为设计靶向调控LMP-1 TMD5三聚化的抑制剂提供了指导。本研究为以跨膜域蛋白-蛋白相互作用为靶点的药物设计研究提供了一种范式,并为理性设计靶向跨膜域PPIs的小分子及多肽抑制剂提供了范例。