肝纤维化(hepatic/liver fibrosis,HF)是一种常见的病症,是指由各种致病因素引起的肝脏损伤和炎症,在修复过程中导致肝脏细胞外基质异常增多和过度沉积的病理过程。引起肝纤维化的因素很多,如病毒感染、乙醇、寄生虫、化学毒物等,有的也可能是多种致病因素共同作用的结果。肝纤维化具有地区差异性,在欧美国家以酒精性肝纤维化为主,在我国主要与病毒性肝炎有关,其中乙型肝炎病毒感染与肝纤维化有着非常密切的关系。肝纤维化治疗效果差,重则演变为肝硬化和肝癌,预后极不良。目前,治疗肝纤维化的药物种类很多,主要是通过作用于肝纤维化发生的不同环节,达到抗肝纤维化的目的,包括针对肝星状细胞(hepatic stellate cell,HSC)的药物、针对细胞因子的药物、影响胶原合成及代谢的药物、保护和阻止肝损伤的药物以及抗肝纤维化的中医药等,其中中医药治疗肝纤维化有很多的优势。肝纤维化和肝硬化在中医理论中属正虚血瘀症的范畴,治疗以活血化瘀、益气养阴为主,兼以养血柔肝和滋补肝肾；中药治疗肝纤维化的作用是多环节和多靶点的：减轻肝细胞炎症坏死、改善肝脏血液循环、促进肝细胞再生、直接抑制HSC活化和增殖、减少胶原分泌、促进胶原降解和再吸收等。近年来,国内外大量实验和临床研究发现,中药特别是复方中药治疗肝纤维化的作用为多环节、多靶点的,与化学合成药往往仅作用在单一环节或靶点相比,有独特的优势,值得深入研究。基因芯片是20世纪生命科学领域发展起来的一项重要技术平台,具有高通量和快速测量等优点。随着基因芯片技术的广泛应用以及生物信息学的飞速发展,肝纤维化发生和发展的许多分子事件得到更全面的揭示。实验研究及临床试验证实,针对单一靶基因的药物治疗疗效有限,而针对多种靶基因或靶蛋白的药物治疗可能会更有效。本研究将利用基于基因表达谱的药物发现模式,通过Toppgene等生物信息学分析方法筛选肝纤维化治疗候选化合物或药物,并进行相关实验验证,为肝纤维化的综合治疗及提高疗效提供理论及实验依据,同时也为加速肝纤维化中药治疗药物发现进程、为中药“老药新用”及中药现代化提供依据。本研究内容主要分为三个部分：第一部分基于基因表达谱的肝纤维化生物信息学分析目的：本研究利用基因芯片数据分析软件BRB-ArrayTools 3.7.1,对来自基因芯片公共数据库(Gene Expression Omnibus, GEO)的肝纤维化基因表达谱芯片数据进行挖掘,并进行生物信息学分析,探讨基于基因表达谱的途径筛选和发现新的肝纤维化治疗药物。方法与结果：1.从GEO获取肝纤维化基因表达谱数据集从NCBI的GEO数据库获得肝纤维化基因表达谱数据集,即GSE11536。该数据集来源于法国ROUEN医药系,采用GPL5215芯片平台,共48个样本,包括8个轻度肝纤维化样本和8个重度肝纤维化样本,每个样本三个重复。2.肝纤维化差异表达基因分析为了获得肝纤维化差异基因表达谱,我们采用BRB软件对GSE11536数据集进行差异表达基因分析,获得差异表达基因297个,其中上调基因115个,下调基因182个(Fold change> 1.5)。3.文献挖掘获得已知肝纤维化疾病基因采用Genecards和FABLE在线工具分析,共获得已知肝纤维化相关基因663个。4. Toppgene筛选肝纤维化相关基因首先建立已知肝纤维化相关基因集文件,然后通过toppgene在线分析工具进行肝纤维化候选基因筛选,结果得到7个肝纤维化候选新基因,分别是：SERPING1、ETS2、TSG101、CDH2、LMO2、PAWR、MST1。5.肝纤维化信号通路富集分析为从生物学意义水平上发现一些与肝纤维化密切相关的信号通路,采用Toppgene对所获取的差异基因表达谱进行基因集富集分析,共富集到44条通路(P<0.05)。对44条富集通路进行分析,结果显示,28条富集通路与凝血有关,3条与血小板生成有关,4条与心肌梗塞有关,6条与脂代谢有关,2条涉及MAPK途径。6.肝纤维化差异基因富集相关疾病分析为了解与肝纤维化相关联的疾病,采用Toppgene对所获取的肝纤维化差异基因进行富集相关疾病分析,共富集到4种疾病(P<0.05),分别是肝炎、先天性纤维蛋白原缺乏血症、后天纤维蛋白原缺乏血症和高密度脂蛋白胆固醇血症,这提示肝纤维化可能与凝血障碍和血脂代谢异常有关。7.肝纤维化候选药物分析Toppgene还建立了疾病、基因与药物之间的联系,为了获得一些可以逆转或是改善肝纤维化基因表达谱的治疗药物,进行Toppgene分析,结果得到69种药物(P<0.001)。结合文献,对69种药物进行分析,结果显示,17种药物是性激素类药物,12种是凝血相关药物,11种是降血脂药,6种是降血糖药,9种是消炎止痛药,这提示性激素类、凝血相关药物和降血脂药物可能可以成为肝纤维化治疗药物或辅助治疗药物。结论：基于基因表达谱的途径筛选和发现肝纤维化治疗相关药物是可行的,并筛选到一些激素类药物、凝血相关药物和降血脂药物可能可以成为肝纤维化候选治疗药物或辅助治疗药物。第二部分肝纤维化的治疗药物Dioscorea panthaica筛选目的：黄山药(Dioscorea panthaica Prain et Burkill)是一种十分重要的食药两用植物资源,中医常用于治疗炭疽、胃痛、风湿性心脏病和风湿性关节炎；黄山药水提取物还可以用于治疗鼠高胆固醇血症。以黄山药根茎提取物为主要原料制成的地奥心血康,是国家二类新药,年销售收入达六亿元,临床主要用于心血管疾病、降血脂、降血糖,其主要化学成分是薯蓣皂甙元,还可作为性激素等多种药物的原料药等。结合第一部分结果：激素类药物、凝血相关药物和降血脂药物可能可以成为肝纤维化候选治疗药物或辅助治疗药物,因此本部分采用生物信息学方法寻找Dioscorea panthaica抗肝纤维化的可能作用靶点,并进行深入分析确认Dioscorea panthaica具有抑制肝纤维化的作用,为下一步进行相关实验验证提供依据。方法与结果：1.文献挖掘Dioscorea panthaica相关靶基因采用FABLE在线工具,结合FACTA文献分析,共获得Dioscorea panthaica相关靶基因1142个。2. Dioscorea panthaica抗肝纤维化的可能作用靶点采用venny分析工具,分析已知肝纤维化相关基因和Dioscorea panthaica相关靶基因的共同表达基因,结果表明,在663个已知肝纤维化相关基因中,存在Dioscorea panthaica的可能作用靶基因322个(占48.6%),这进一步提示Dioscorea panthaica有抑制肝纤维化的作用。3.获得共同表达基因为了解Dioscorea panthaica抑制肝纤维化的可能作用机制,结合肝纤维化差异基因集,采用venny分析工具进行分析,获得肝纤维化差异基因、已知肝纤维化相关基因和Dioscorea panthaica相关靶基因的共同表达基因14个,分别是：APOA1、APOB、F2、GC、NR3Cl、TF、VTN、C3、C5、KNG1、NCF1、PAH、STAT3、TGFBR1。4.共同表达基因集通路富集分析将14个共同表达基因进行通路富集分析,结果显示有11条生物信号通路可能参与Dioscorea panthaica抑制肝纤维化的分子机制(P<0.05),这些信号通路主要涉及局部急性炎症应答反应、补体凝血过程、活性肽诱导通路.FOXA2/FOXA3转录因子调控网络、脂蛋白代谢等信号通路。结论：通过生物信息学分析预测,进一步提示Dioscorea panthaica有抑制肝纤维化的作用。第三部分Dioscorea panthaica抑制肝纤维化的相关实验验证目的：为验证前两部分的分析结果,本部分采用CCl4法造大鼠肝纤维化模型,探讨Dioscorea panthaica提取物抑制肝纤维化的效果。方法与结果：1.CCl4诱导大鼠肝纤维化模型的建立、分组及给药方法健康雄性SD大鼠,36只,随机分为6组,每组6只：①正常对照组(n=6),给予橄榄油1mL/kg体重(2次/周)腹腔内注射,共8周；②模型诱导对照CCl4组(n=6),给予CCl4(CCl4橄榄油=4：6)3mL/kg体重,每周两次,共8周；③阳性对照秋水仙碱组(n=6),按0.1 mg/kg体重腹腔注射秋水仙碱,每天1次,同时给予CCl4(CCl4橄榄油=4：6)3mL/kg体重,每周两次,共8周；④DPE-50mg/kg组(n=6),按50 mg/kg体重灌胃Dioscorea panthaica提取物(DPE),每天1次,同时给予CCl4(CCl4橄榄油=4：6)3mL/kg体重,每周两次,共8周；⑤DPE-100mg/kg组(n=6),按100mg/kg体重灌胃DPE,每天1次,同时给予CCl4(CCl4橄榄油=4：6)3mL/kg体重,每周两次,共8周；⑥DPE-200mg/kg组(n=6),按200mg/kg体重灌胃DPE,每天1次,同时给予CCl4(CCl4橄榄油=4：6)3mL/kg体重,每周两次,共8次。各组大鼠均于8周后处死,处死前禁食24h。处死时,大鼠用水合氯醛麻醉,迅速从心脏穿刺取血,分离血清,-80℃保存。平卧状态下剖腹,去除肝脏筋膜,取右叶相同的部分置于冰生理盐水中充分洗涤后,一部分用10%中性甲醛固定,3天内石蜡包埋,切片,以备组织病理检测；其余肝组织迅速置于液氮中保存。2.DPE对血清ALT、AST含量的影响血清AST和ALT是评价肝脏损伤常用的生化指标。取大鼠血液约3mL,置干燥玻璃管内,37℃温浴30min,4℃冰箱静置2h,3000g离心10min,取血清,-80℃保存。通过全自动生化分析仪测定各组大鼠血清ALT、AST含量。与正常对照组相比,肝纤维化模型对照组的血清ALT含量(P=0.000)和AST含量(P=0.000)显著提高,DPE处理组的血清ALT、AST含量呈剂量依赖性下降。3.肝组织病理学改变及检测肝组织中羟脯氨酸水平运用HE染色和Masson’染色对各组大鼠肝组织纤维化程度进行分析,结果显示,正常对照组大鼠的肝组织肝索结构清晰,肝细胞以中央静脉为中心呈放射状,肝组织内无脂肪空泡,仅汇管区和中央静脉有少许胶原纤维存在。模型对照组肝小叶结构破坏,纤维组织增生明显,将肝小叶分隔成大小不等的肝细胞团,肝细胞广泛变性坏死,汇管区扩大、胶原大量沉积。与模型对照组相比,治疗组肝细胞的变性坏死程度及肝小叶结构破坏程度降低,肝脏胶原纤维增生亦明显减轻。在检测肝脏组织病理学改变的同时,通过检测肝组织中羟脯氨酸水平,对肝损伤纤维化程度进行定量分析。与正常对照组相比,模型对照组的羟脯氨酸含量显著提高,差异有统计学意义(P=0.000),DPE处理组的羟脯氨酸含量呈剂量依赖性下降。4.DPE对肝组织抗氧化能力的影响通过检测大鼠肝组织匀浆中的GSH和TBARS浓度,探讨DPE治疗对肝组织氧化状态的影响。GSH构成了拮抗自由基的第一道防线。与正常对照组GSH含量相比,肝纤维化模型对照组GSH含量显著降低(P=0.000)；与肝纤维化模型对照组GSH含量相比,阳性对照秋水仙碱组(P=0.000)和DPE处理组(P=0.000)肝组织GSH含量差异均有统计学意义。为检测肝组织氧化性能,结果显示,与正常对照组比较,肝纤维化模型对照组TBARS含量增加约3.2倍；DPE (200mg/Kg)处理组肝脏TBARS含量降至1.03±0.12μmol/g,表明肝组织抗氧化能力增强。结论：经动物实验证实,Dioscorea panthaica提取物能显著降低CCl4诱导的大鼠肝纤维化。