论文部分内容阅读
黄瓜是一种重要的世界性蔬菜,黄瓜生产过程中对氮肥的需求量较大。随着生产者对黄瓜产量和效益追求的不断提高，在黄瓜生产过程中氮肥施用量就在不断的增加，黄瓜的生产成本就不断提高，造成农民的生产负担越来越重，而且氮肥施用量的增加还使得黄瓜果实中亚硝酸盐含量增加，影响黄瓜的品质和人类的健康，并且现在大量的氮肥随着雨水流到湖泊、海洋等造成环境污染。因此，提高黄瓜品种的耐低氮性，不仅可以有效减少氮肥施用量，降低生产成本，减少对环境的污染，而且还可以减少黄瓜果实中硝酸盐的积累，防止对人类健康的危害。钙依赖蛋白激酶CDPKs(Calcium-dependent Protein Kinases， CDPKs)，磷酸化蔗糖合成途径的关键酶——蔗糖磷酸合成酶(SPS)和硝酸盐同化氮素的限速酶——硝酸还原酶(NR)，参与植物的碳氮代谢和抗逆反应。本试验室前期在对低氮胁迫下黄瓜叶片Solexa测序研究中发现黄瓜叶片中的CDPK基因在低氮胁迫下表达量增加，推测CDPK基因可能参与了低氮胁迫中某些信号的转导，提高黄瓜的耐低氮能力。因此，进行黄瓜CDPK基因的克隆及其对黄瓜和拟南芥的转化，可为揭示该基因在低氮胁迫中的作用机理以及耐低氮黄瓜新种质资源创新奠定基础。本试验通过PCR方法成功克隆了黄瓜叶片CDPK基因，并对其核苷酸序列与预测的氨基酸序列进行了分析。在此基础上构建了PBI121-CDPK植物表达载体。通过农杆菌转化，获得过量表达和干扰表达该基因的黄瓜和拟南芥植株。主要研究结果如下：（1）采用RT-PCR方法从黄瓜品种津研四号叶片中成功克隆得到CDPK基因。CDPK基因编码区全长1584bp，编码527个氨基酸，分子量为60007.514Da，等电点为5.195。该基因编码的蛋白是一个稳定的亲水蛋白，无跨膜结构，无信号肽，存在EF手型钙结合区，丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶活性位点，氮糖基化位点等多个位点。同源比对发现，黄瓜CDPK基因编码的蛋白与葡萄、毛果杨、蓖麻CDPK基因编码蛋白同源性高达70%以上，是一个保守的基因。（2）构建PBI121与CDPK基因的正反植物表达载体。（3）利用农杆菌介导法将构建的CDPK基因植物表达载体导入到黄瓜与拟南芥中。经PCR检测，获得8株黄瓜阳性植株，其中有3株为CDPK正表达植株，有5株为CDPK反义表达植株。获得22株拟南芥转化苗，其中有12株正表达植株和10株反义表达植株。