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目的: 构建M1型和M2型巨噬细胞极化平台,观察Hsp16.3对M1型巨噬细胞的作用,并初步探讨其作用机制,为深入探讨Hsp16.3对巨噬细胞极化的作用及机制奠定基础。方法: (1)构建骨髓来源巨噬细胞M1型和M2型极化的技术平台,从Balbc小鼠的胫腓骨中取出骨髓细胞,与GM-CSF共培养得到骨髓来源巨噬细胞M0。用IFN-r诱导M0向M1型极化,用IL-4诱导骨髓来源巨噬细胞向M2极化。荧光定量PCR、ELISA检测IL-12、iNOS、TNF-α、Arg1、IL-4、IL-10、TGF-β细胞因子的表达水平,光镜下观察巨噬细胞的形态。 (2)用荧光定量 PCR、ELISA分别检测结核分枝杆菌 Hsp16.3对M1型巨噬细胞Arg1、IL-10、iNOS、TGF-β、TNF-α表达水平的影响。 (3)Western blot检测结核分枝杆菌 Hsp16.3对M1型巨噬细胞 MAPK、TRAF6、NF-κB、iκB表达水平的影响。 (4)siRNA-TLR4、PMB抑制TLR4的功能后,用荧光定量PCR、ELISA分别检测结核分枝杆菌Hsp16.3对M1型巨噬细胞IL-12、iNOS、TNF-α、Arg1、IL-4、IL-10、TGF-β、IL-6表达水平的影响;用Western blot检测结核分枝杆菌Hsp16.3对M1型巨噬细胞MAPK、TRAF6、NF-κB、iκB表达水平的影响。 结果: (1)荧光定量PCR、ELISA结果显示M1型巨噬细胞的IL-12、iNOS、TNF-α细胞因子的表达水平升高;在光镜下观察诱导得到的骨髓来源巨噬细胞呈现梭形,长突触。荧光定量PCR、ELISA结果显示M2型巨噬细胞的Arg1、IL-4、IL-10、TGF-β细胞因子的表达水平升高;在光镜下观察诱导得到的骨髓来源巨噬细胞伪足较短,形态收拢。 (2)荧光定量 PCR、ELISA结果显示结核分枝杆菌 Hsp16.3引起 M1型细胞因子iNOS、TNF-α表达量下降,M2型细胞因子Arg1、IL-10、TGF-β表达量升高。光镜下,M1型巨噬细胞的伪足缩短。 (3)Western blot结果显示结核分枝杆菌Hsp16.3抑制MAPK、TRAF6、NF-κB、iκB的表达水平。 (4)通过siRNA-TLR4、PMB抑制TLR4受体功能后,荧光定量PCR、ELISA结果显示M1型巨噬细胞的M2型细胞因子IL-10、Arg1、TGF-β的表达量下降,M1型细胞因子iNOS、IL-6、IL-12的表达量升高。Western blot结果显示结核分枝杆菌Hsp16.3抑制MAPK、TRAF6、NF-κB、iκB的表达水平。 结论: (1)成功诱导小鼠骨髓来源的M1、M2型巨噬细胞; (2)结核分枝杆菌Hsp16.3可以促进M1型巨噬细胞高表达M2型相关的细胞因子,可促进M1型巨噬细胞向M2样巨噬细胞转换; (3)结核分枝杆菌Hsp16.3对M1型巨噬细胞的作用机制,可通过TLR4所介导的MAPK-NF-κB信号通路发挥作用。