组织工程(Tissue Engineering)概念自20世纪80年代提出以来得到了迅速的发展，其基本原理和方法是：将体外培养扩增的正常组织细胞吸附于一种生物相容性良好并可被机体吸收的生物材料上形成复合物，将细胞—生物材料复合物植入机体组织或器官病损部位，细胞在生物材料逐渐被机体降解吸收的过程中形成新的具有形态和功能的相应组织、器官，达到修复创伤和重建功能的目的。采用组织工程技术体外构建人工组织或器官，给急需组织修复和器官移植的病人带来了曙光。利用生物材料构建的三维支架为细胞生长和功能化提供人工细胞外基质和三维支撑。同时支架材料还能做为模板引导组织生长和整合，提供特殊的生物活性信号，诱导细胞定向分化和维持细胞功能。因此在为组织形成构建特定环境时支架材料的选择及其物理和化学性质是关键。最近组织工程研究的重要趋势是设计和制备在结构和功能上仿生的支架材料，通过在支架中引入物理或/和化学生物信号获得特异性细胞反应，达到引导组织再生的目的。 因此，本论文研究首先构建具有纳米/微米多级孔结构的聚乳酸类三维支架，模仿天然细胞外基质中胶原的显微结构——纳米或亚微米纤维网络，采用相分离技术构建出系列具有微米多通道、微米孔径和纳米纤维的聚乳酸类组织工程支架，研究了支架微结构与细胞之间的相互作用。在此基础上，利用静电纺丝技术制备具有不同拓扑形貌的纳米纤维；合成出一种含端功能基团的PLLA，通过化学方式键合两种层粘连蛋白衍生短肽。然后在2D支架中考察了它们在促进神经细胞粘附和轴突长出的作用，为进一步仿生制备同时具有生物学信息和物理诱导功能的组织工程支架提供科学依据。具体如下： 一、具有多纵向排列通道、多级孔结构的PLGA导管的制备及在脊髓损伤修复中应用研究 神经导管可为神经修复提供一个合适的微环境，使得神经纤维能够再生并顺利到达远端。在本章节研究中我们采用热诱导相分离和低温注射成型相结合的技术制备出具有可控多纵向排列通道、大孔/微孔多级结构的PLGA神经导管。神经导管的外径及内部通道的数目和内径可以通过改变模具结构控制，通道之间壁的多孔结构可以通过调节PLGA溶液浓度和进一步加入致孔剂控制。体外降解实验显示7通道神经导管在37℃ PBS缓冲溶液中能够保持外形12周，降解液pH值维持在4.1-4.5之间。大鼠脊髓间充质干细胞(rat MSCs)单独培养或者与大鼠雪旺细胞(rat SCs)共培养时能够在神经导管中很好的黏附、伸展和增殖，显示出神经导管具有良好的细胞相容性。PLGA神经导管体内移植到大鼠脊髓能够很好的与宿主结合，没有发生明显的炎症反应，并且有宿主细胞向导管内迁移，结果显示导管在大鼠脊髓组织内具有良好的相容性。因此本章节研究中所制备的PLGA多纵向排列通道、多级孔结构的神经导管在脊髓损伤修复中具有潜在的应用前景。 二、具有纳米纤维结构的PCL—b—PLLA(50/50)三维多孔支架的制备与性能研究 采用液—液相分离和盐沥滤相结合的技术制备出PCL—b—PLLA三维多孔纳米纤维支架，支架大孔孔径为144±36μm，孔壁由直径为151±56 nm的纳米纤维网络构成。DSC结果显示嵌段共聚物PCL—b—PLLA为半晶质聚合物，PCL链段和PLA链段在体系凝胶化过程中分别结晶但相互又有一定的干扰。低温条件下易于凝胶化形成结晶微区，滤出溶剂冷冻干燥后即得到纳米纤维结构。纳米纤维的形貌与凝胶化温度相关，当5％(W/V) PCL—b—PLLA/THF溶液在—20℃和—40℃凝胶化时能够形成均匀的纳米纤维网络，而在4℃凝胶化时在纳米纤维网络中出现片状节点，升高凝胶化温度会增大片状结构面积进而形成连续结构。这主要是因为PCL链段在THF溶液中的凝胶化温度较低，以及PCL分子链重排受到PLA刚性段的干扰而致使结晶度下降，无定型部分比例升高。与平滑的实体孔壁相比，纳米纤维结构能够促进软骨细胞黏附和细胞外基质的合成，纳米纤维支架上软骨细胞中蛋白质含量和DNA含量分别是平滑实体孔壁支架上的1.3-1.4和1.2-1.4倍。研究结果表明这种具有多孔和纳米纤维结构的PCL—b—PLLA三维支架在软骨组织工程中具有广阔的应用价值。 三、改进相分离技术制备具有可控孔结构的PLLA纳米纤维支架 单独以THF为溶剂制备的纳米纤维支架中微孔孔径在10μm以下，大大限制了该技术在组织工程中的应用。在本章节研究中我们以二氧六环/水为共溶剂，制备出同时具有大孔/微孔和纳米纤维结构的PLLA三维支架。支架中大孔孔径主要由相分离过程中粗化因素决定，而纳米纤维网络的形成则是由凝胶化过程中PLLA结晶引起。凝胶化温度和双组分溶剂比例是影响支架形貌的两个重要因素。当凝胶化温度为12℃，水含量分别为10％和12％时，支架中微孔直径为50±25μm，孔壁由纤维直径在50-200 nm之间的纳米纤维网络构成。升高凝胶化温度或者增加水在双组分溶剂中含量，支架孔径增加，甚至会产生直径达300μm的大孔。但是当凝胶化温度高于12℃或水含量超过12％时，观察到尺寸在微米级的片状结构而非纳米纤维网络。DSC分析结果显示PLLA纳米纤维支架材料的结晶度随凝胶化温度升高和水含量增加而升高，XRD结果进一步显示纳米纤维结构中PLLA主要表现为α晶型，而片状结构所对应的晶型主要为α型。SEM和MTT检测结果显示纳米纤维支架为大鼠脊髓间充质干细胞(rat MSCs)黏附、伸展和增殖提供了一个比片状结构支架更好的环境。 四、具有不同拓扑形貌的PLLA静电纺丝纳米纤维的制备及对C17.2神经干细胞生长和分化的影响 纳米纤维能够模仿天然细胞外基质的物理结构，为细胞生长提供了一个良好的环境。然而细胞—纳米纤维作用以及纳米纤维拓扑形貌例如直径和取向对细胞生长和功能的影响在以往研究中却很少涉及，而细胞—材料作用在组织工程支架研究中具有重要的指导意义。在本章节中我们采用静电纺丝技术制备了一系列具有不同取向和不同纤维直径的PLLA纤维支架。纵向排列纤维的直径在307±47 nm～917±84 nm之间，无规分布纤维的直径在327±40 nm～1150±109 nm之间。纤维的直径受各种因素影响，包括聚合物浓度、溶剂、电压以及环境温度和湿度。新生小鼠小脑C17.2干细胞在PLLA纤维上的活性和增殖不但受纤维直径的影响而且也受到纤维支架的孔径影响。较小直径的纤维能够吸附更多的营养因子因而能促进细胞黏附和增殖，但太小的纤维直径会产生较小的孔径反而抑制细胞在纤维支架上渗透。纤维纵向排列时能够引导细胞沿着纤维长轴方向生长和伸展，最后形成极化和拉长的胞体。而在无规分布纤维上的细胞则呈现出无规分布的梭形或者多角形。与无规分布纤维相比，纤维纵向排列时能促进细胞长出更长的神经轴突，突显其接触引导效应。因此我们的研究为纤维支架的设计和制备提供了重要的参考价值。 五、两种层粘连蛋白衍生短肽序列修饰改性PLLA及对C17.2神经干细胞生长和分化影响 大量可降解吸收的聚酯类高分子已经广泛应用于组织工程和药物载体，但是由于缺乏功能基团，不能连接生物活性分子，其应用也受到限制。在本章节中，首先合成赖氨酸封端的PLLA[K—(CH2)n—PLLA(n=2，5，8)]，通过改变赖氨酸与PLLA主链亚甲基数目调节连接末端氨基的臂长；然后将K—(CH2)n—PLLA与PLLA(10/90，W/W)复合浇注成膜，采用极性水溶剂诱导聚合物中氨基向膜表面聚集。原子力显微镜观察结果显示复合膜与纯PLLA膜相比表面粗糙度增加，由于K—(CH2)n—PLLA分子链末端氨基和PLLA主链骨架亲水性的差异，复合膜表面出现微相分离现象。增加PLLA主链与赖氨酸的连接臂长、延长水诱导时间可以进一步增加膜的粗糙度，促进微相分离。利用双偶联剂Sulfo—SMCC将存在于层粘连蛋白中的两个短肽序列CYIGSR(Cys—Tyr—Ile—Gly—Ser—Arg)和CSIKVAV(Cys—Ser—Ile—Lys—Val—Ala—Val)与复合膜表面氨基键合，实现了短肽修饰PLLA的目的。与纯PLLA膜相比，短肽修饰复合膜能够提高新生小鼠小脑C17.2细胞的活性，促进细胞长出更长的神经轴突，当连接臂长为5个亚甲基时(对应于K—(CH2)5-PLLA/PLLA)，复合膜表面短肽密度达最大值(0.28±0.03μg/c㎡)，短肽对C17.2细胞的粘附和轴突长出的促进作用最为显著。因此本章节的研究建立了一种以赖氨酸端基化的PLLA化学键合层粘连蛋白衍生短肽来促进神经细胞粘附和轴突长出的新方法，该方法对于聚酯的改性和组织工程支架材料的短肽修饰具有参考价值。