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目的:糖尿病患病率呈逐年上升趋势,且中国糖尿病患病位居世界第一。胰岛β细胞功能障碍和死亡是糖尿病血糖升高的直接原因。了解胰岛β细胞衰竭的分子机制对提出胰岛β细胞保护的新方法具有重要意义。研究表明,1型糖尿病（Type 1 Diabetes Mellitus,T1DM）和2型糖尿病（Type 2 Diabetes Mellitus,T2DM）患者的胰岛β细胞出现氧化应激和内质网应激,其中内质网应激可以引起胰岛β细胞损伤,诱发胰岛素分泌功能受损。核转录因子E2相关因子2（Nuclear factor erythroid 2-related factor 2,Nrf2）通过调控抗氧化应激通路参与糖尿病的发生发展。然而,Nrf2是如何参与内质网应激信号通路而影响胰岛β细胞及其具体机制尚不完全清晰。因此,本研究主要研究Nrf2在内质网应激所致胰岛β细胞损伤和糖尿病中的作用及其机制。本研究运用Nrf2敲除小鼠和Akita糖尿病小鼠杂交模型和Nrf2稳定沉默模型,探讨Nrf2在内质网应激条件下对胰岛β细胞功能障碍和细胞损伤中的作用。研究方法:1.小鼠基础指标检测:将Nrf2敲除小鼠与Akita糖尿病小鼠模型杂交,获得Nrf2-WT,Ins2+/+、Nrf2-KO,Ins2+/+、Nrf2-WT,Ins2+/Akita和Nrf2-KO,Ins2+/Akita四组小鼠,检测体重、空腹血糖、餐后血糖、葡萄糖耐量实验（Glucose tolerance test,GTT）、体成分、各脏器系数等基础指标;应用小动物代谢测量分析系统进行小鼠基础代谢指标分析;应用放射免疫胰岛素检测试剂盒检测四组小鼠血清基础胰岛素水平（Basal Insulin）、葡萄糖刺激下的胰岛素分泌（Glucose stimulated insulin secretion,GSIS）等指标;2.形态学观察:对四组小鼠胰腺组织进行H&E染色、胰岛素和胰高血糖素的免疫组织化学染色、免疫荧光染色,各组胰岛中TUNEL染色与胰岛素荧光共染;3.细胞实验及染毒实验:利用sh RNA技术建立Nrf2稳定低表达的小鼠胰岛β细胞系MIN6细胞（Nrf2-KD MIN6）,给予不同时间剂量的细胞内质网应激源毒胡萝卜素（Thapsigargin,TG）、衣霉素（Tunicamycin,TUN）处理,通过四甲基偶氮唑蓝法（Methyl Thiazolyl Tetrazolium,MTT）检测细胞活力、ATP检测试剂盒测定各组细胞内ATP含量,分析TG、TUN处理后各组细胞间的差异;4.细胞蛋白表达检测:应用Western Blot技术对胰岛素（Insulin）、胰岛素原（Proinsulin）、凋亡标志物裂解半胱天冬酶3（Cleaved caspase 3）和裂解多聚ADP-核糖聚合酶1（Cleaved Poly ADP-Ribose Polymerase,Cleaved PARP）以及未折叠蛋白反应蛋白免疫球蛋白结合蛋白（Binding immunoglobulin protein,BIP）、真核翻译起始因子（Eukaryotic translation initiation factor-α,e IF2α）、核转录因子X盒结合蛋白（X-box binding protein 1,XBP1）、转录因子C/EBP同源蛋白（C/EBP-homologous protein,CHOP）、蛋白质二硫键异构酶（Protein disulfide isomerase,PDI）、转录激活因子6（Activating transcription factor 6,ATF6α）、硫氧还蛋白互作蛋白（Thioredoxin-interacting protein,TXNIP）等进行检测;5.数据分析:所有数据将应用统计软件Graphpad Prism 5进行绘图与统计分析。结果:1.小鼠体重监测结果:对Nrf2-WT,Ins2+/+、Nrf2-KO,Ins2+/+、Nrf2-WT,Ins2+/Akita和Nrf2-KO,Ins2+/Akita四组实验小鼠体重监测发现,Nrf2-WT,Ins2+/Akita和Nrf2-KO,Ins2+/Akita糖尿病小鼠相比Nrf2-WT,Ins2+/+和Nrf2-KO,Ins2+/+非糖尿病小鼠从5周龄开始体重有显著降低,而Nrf2-WT,Ins2+/Akita与Nrf2-KO,Ins2+/Akita组相比无显著差异;2.小鼠血糖监测结果:对Nrf2-WT,Ins2+/+、Nrf2-KO,Ins2+/+、Nrf2-WT,Ins2+/Akita和Nrf2-KO,Ins2+/Akita四组实验小鼠血糖监测发现,Nrf2-WT,Ins2+/Akita和Nrf2-KO,Ins2+/Akita糖尿病小鼠相比Nrf2-WT,Ins2+/+和Nrf2-KO,Ins2+/+非糖尿病小鼠禁食血糖以及餐后血糖有显著升高,而Nrf2-WT,Ins2+/Akita与Nrf2-KO,Ins2+/Akita两组小鼠相比禁食血糖以及餐后血糖均无显著性差异;对19周龄小鼠进行GTT实验检测发现,Nrf2-WT,Ins2+/Akita和Nrf2-KO,Ins2+/Akita糖尿病小鼠相比Nrf2-WT,Ins2+/+和Nrf2-KO,Ins2+/+非糖尿病小鼠葡萄糖不耐受（P<0.05）,且Nrf2-KO,Ins2+/Akita小鼠较Nrf2-WT,Ins2+/Akita小鼠出现更严重的葡萄糖不耐受,AUC曲线下面积值升高。提示Nrf2-KO,Ins2+/Akita小鼠胰岛β细胞出现更严重的损伤并且对血糖的调节能力减弱;3.小鼠基础代谢指标分析结果:对Nrf2-WT,Ins2+/+、Nrf2-KO,Ins2+/+、Nrf2-WT,Ins2+/Akita和Nrf2-KO,Ins2+/Akita四组实验小鼠代谢笼分析显示,Nrf2-WT,Ins2+/Akita和Nrf2-KO,Ins2+/Akita糖尿病小鼠相比Nrf2-WT,Ins2+/+和Nrf2-KO,Ins2+/+非糖尿病小鼠各组间氧气消耗、二氧化碳产出、能量平衡均有增加趋势,摄食量及饮水量显著增加,而自主运动能力、呼吸商显著减弱,且Nrf2-KO,Ins2+/Akita小鼠较Nrf2-WT,Ins2+/Akita小鼠呼吸商显著降低;表明Nrf2-KO,Ins2+/Akita小鼠整体代谢出现异常;4.血清学指标检测结果:对20周龄小鼠禁食状态、餐后状态以及给予葡萄糖刺激15 min后的血清进行血清胰岛素检测发现,Nrf2-WT,Ins2+/Akita和Nrf2-KO,Ins2+/Akita糖尿病小鼠相比Nrf2-WT,Ins2+/+和Nrf2-KO,Ins2+/+非糖尿病小鼠基础胰岛素、GSIS水平均较低,且Nrf2-KO,Ins2+/Akita小鼠基础胰岛素、GSIS水平低于Nrf2-WT,Ins2+/Akita小鼠（P<0.05）,表明Nrf2-KO,Ins2+/Akita小鼠胰岛β细胞分泌胰岛素功能降低,提示Nrf2基因缺失后小鼠的胰岛β细胞损伤更严重;5.形态学观察结果:胰腺组织H&E染色显示,Nrf2-WT,Ins2+/Akita和Nrf2-KO,Ins2+/Akita糖尿病小鼠相比Nrf2-WT,Ins2+/+和Nrf2-KO,Ins2+/+非糖尿病小鼠胰岛变小且胰岛数量减少。Nrf2-KO,Ins2+/Akita组与Nrf2-WT,Ins2+/Akita组相比,胰岛质量显著减小,提示胰腺内胰岛丢失更多。免疫组织化学染色后定量结果显示,Nrf2-WT,Ins2+/Akita和Nrf2-KO,Ins2+/Akita糖尿病小鼠相比Nrf2-WT,Ins2+/+和Nrf2-KO,Ins2+/+非糖尿病小鼠胰岛内胰岛素表达较低,Nrf2-KO,Ins2+/Akita小鼠较其它三组小鼠胰岛素表达最低;Nrf2-WT,Ins2+/Akita和Nrf2-KO,Ins2+/Akita糖尿病小鼠相比Nrf2-WT,Ins2+/+和Nrf2-KO,Ins2+/+非糖尿病小鼠胰岛内胰高血糖素阳性细胞移位,胰岛结构发生改变。对胰腺组织进行胰岛素与胰高血糖素免疫荧光共染的结果也提示,Nrf2-WT,Ins2+/Akita和Nrf2-KO,Ins2+/Akita糖尿病小鼠相比Nrf2-WT,Ins2+/+和Nrf2-KO,Ins2+/+非糖尿病小鼠胰岛内胰岛素荧光强度减弱以及胰岛β细胞数量减少,且Nrf2-KO,Ins2+/Akita小鼠较其它三组小鼠胰岛内胰岛素荧光强度最弱且胰岛β细胞数量最少,差异具有统计学意义;6.TUNEL染色与胰岛素荧光共染结果:胰腺组织TUNEL染色与胰岛素荧光共染结果显示,Nrf2-WT,Ins2+/Akita和Nrf2-KO,Ins2+/Akita糖尿病小鼠胰岛内胰岛β细胞出现细胞凋亡,且Nrf2-KO,Ins2+/Akita小鼠较其它三组小鼠胰岛β细胞内TUNEL阳染最多;7.细胞损伤及凋亡指标检测:Scramble和Nrf2-KD小鼠胰岛β细胞系MIN6经内质网应激源TG、TUN处理后的细胞活力低于Scramble细胞,差异具有统计学意义。对各组细胞进行ATP含量测定后,Nrf2-KD+TUN,Nrf2-KD+TG组ATP含量低于Scramble+TUN,Scramble+TG组。为了更深入的研究急性内质网应激物诱导胰岛β细胞损伤的可能机制,本研究检测TG和TUN急性暴露后的凋亡标志物Cleaved caspase 3和Cleaved PARP。在Nrf2-KD+TG和Nrf2-KD+TUN细胞中,这些标志物表达更高,结果表明Nrf2-KD MIN6细胞对内质网应激诱导的细胞毒性更敏感并且出现凋亡增加;8.未折叠蛋白反应水平检测:Scramble和Nrf2-KD小鼠胰岛β细胞系MIN6经内质网应激源TG、TUN处理后内质网应激相关指标BIP、ATF6a、XBP1、CHOP蛋白均显著上调,而Nrf2-KD+TUN组较Scramble+TUN组内质网应激相关蛋白BIP、ATF6a、XBP1蛋白表达显著降低,而TXNIP蛋白表达显著增加。Nrf2-KD+TUN,Nrf2-KD+TG组较Scramble+TUN,Scramble+TG组胰岛素蛋白表达显著降低,而胰岛素原蛋白表达无显著性差异。结论:Nrf2基因缺失的Akita小鼠的胰岛β细胞损伤更严重;Nrf2通过增加适应性未折叠蛋白反应的分子伴侣BIP以及ATF6α表达来减少胰岛素原蛋白在内质网中的大量积累,减少TXNIP表达减轻内质网应激诱导的损伤,进而减少胰岛β细胞凋亡,减轻糖尿病的进程。