目的重型再生障碍性贫血（SAA）是由于免疫耐受被打破,功能亢进的T淋巴细胞攻击造血系统而引起发病。我们既往研究发现SAA患者NK细胞数目下降,其在SAA发病中可能发挥“保护性”作用,但NK细胞在SAA免疫发病机制中如何发挥“保护性”作用仍不完全清楚。最近的研究发现TIM3可能参与NK细胞功能的调节。本研究主要检测SAA患者外周血NK细胞TIM3表达水平,同时探讨TIM3⁺NK与TIM3^—NK细胞功能活性差异以及NK细胞TIM3表达减低的原因;构建免疫介导的SAA小鼠模型,观察TIM3阻断剂、TIM3⁺NK及TIM3^—NK细胞回输治疗SAA小鼠模型疗效,以及与CsA治疗是否有协同效应,为进一步完善SAA免疫发病机制及提高疗效提供新的诊疗思路。方法选取天津医科大学总医院血液科自2017年1月至2018年12月收入院的初治SAA患者18例、经免疫抑制治疗（IST）后缓解的SAA患者18例,以及健康志愿者15名。第一部分:1.应用流式细胞术（FCM）检测SAA患者及正常人外周血NK细胞及其亚群CD56^bright、CD56^dimim NK细胞胞膜TIM3表达率2.采用MACS分选SAA患者外周血NK细胞,用RT-PCR的方法检测NK细胞TIM3 mRNA相对表达量,比较SAA患者与正常对照之间的差异性。3.将NK细胞TIM3水平变化与SAA患者血细胞减少程度及其他免疫细胞状态作相关性分析。第二部分:1.应用FCM检测SAA患者及正常人外周血TIM3⁺NK及TIM3^—NK细胞功能分子表达。2.采用MACS分选SAA患者TIM3⁺NK及TIM3^—NK细胞并进行体外扩增,另将同一患者单核细胞经体外诱导分化为mDC细胞,将上述TIM3⁺NK及TIM3^—NK细胞与mDC共同孵育,检测NK细胞TIM3表达高低对mDC功能分子CD80、CD86表达的影响。3.另将SAA患者采用MACS分选的Treg细胞进行体外扩增,将上述TIM3⁺NK及TIM3^—NK细胞与Treg细胞进行共孵育,检测NK细胞TIM3表达高低对Treg细胞功能分子CTLA-4、CD39的变化。4.将MACS分选的TIM3⁺NK及TIM3^—NK细胞与K562细胞进行共孵育,检测TIM3⁺NK及TIM3^—NK细胞对K562细胞凋亡率的影响。5.通过Western-blot检测TIM3⁺NK及TIM3^—NK细胞受体后信号通路蛋白AKT、P-AKT的变化,比较两组细胞功能活性的高低。6.用RT-PCR的方法检测NK细胞转录因子T-bet及Eomes mRNA表达水平是否与NK细胞TIM3表达高低相关。第三部分:成功构建免疫介导的SAA小鼠模型。通过血常规、骨髓病理验证造模是否成功。1.应用FCM检测SAA模型、单纯照射及正常小鼠NK细胞胞膜TIM3表达及功能分子NKG2A、NKG2D的表达,通过Western-blot检测TIM3⁺NK及TIM3^—NK细胞受体后信号通路蛋白（AKT、P-AKT及PI3K）的变化,比较两组细胞功能活性的高低。2.对SAA模型小鼠进行治疗干预,分为正常对照组（NC组）,单纯照射组（TBI组）及再障组（AA组）,CsA治疗组,TIM3⁺NK细胞输注治疗组（TIM3⁺NK）,TIM3^—NK细胞输注治疗组（TIM3^—NK）,CsA联合TIM3^—NK细胞输注治疗组（CsA+TIM3^—NK）,TIM3阻断剂治疗组（TIM3 blocker）,CsA联合TIM3阻断剂治疗组（CsA+TIM3 blocker）,分别比较各组小鼠一般情况、体重、血常规、骨髓细胞计数及骨髓组织病理改变。结果第一部分:1.初治SAA患者外周血NK细胞胞膜TIM3表达率显著低于缓解SAA患者（p<0.05）和正常对照组（p<0.01）,而缓解SAA患者与正常对照比较无统计学差异（p>0.05）;初治SAA患者CD56^dim NK细胞TIM3表达率明显低于正常对照组（p<0.01）,而CD56^bright NK细胞TIM3表达率两者相比无统计学差异（p>0.05）。虽然SAA缓解组患者CD56^dim与CD56^bright NK细胞TIM3表达率较SAA初治组患者上升,但差异无统计学意义（p>0.05）。2.分选NK细胞纯度大于90%。初治、缓解SAA患者及正常对照NK细胞TIM3 mRNA相对表达量分别为（0.71±0.47%,1.52±1.05%,1.05±0.72%）,SAA缓解组NK细胞TIM3 mRNA相对表达量较SAA初治组及正常对照组明显升高（p<0.05）,虽然SAA初治组NK细胞TIM3 mRNA相对表达量低于正常对照组,但两者差异无统计学意义（p>0.05）。3.SAA患者总NK细胞TIM3表达率高低与外周血白细胞计数、中性粒细胞比例及网织红细胞比例均呈正相关,而与淋巴细胞比例呈负相关;SAA患者总NK细胞TIM3表达率高低与mDC/pDC、CD8⁺/CD3⁺比值及CD8⁺T细胞颗粒酶B水平呈负相关,而与mDC细胞CD86的表达水平呈正相关;NK细胞TIM3表达率高低与mDC细胞CD80表达水平、CD8⁺T细胞穿孔素分泌及Treg细胞数目无明显相关性。第二部分:1.FCM检测结果显示初治SAA患者TIM3^—NK细胞比TIM3⁺NK细胞表达更高的活化分子NKG2D及颗粒酶B（p<0.05）,而TIM3^—NK细胞抑制性受体NKG2A,CD158a及CD158b表达水平明显低于TIM3⁺NK细胞,（p<0.05）,但在初治SAA患者NKp46,NKp44及穿孔素的表达在TIM3^—NK及TIM3⁺NK两群细胞比较差异无统计学意义（p>0.05）。缓解SAA患者TIM3^—NK细胞比TIM3+NK细胞表达更高的NKG2D及颗粒酶B（p<0.05）,而TIM3^—NK细胞抑制性受体CD158a及CD158b表达水平明显低于TIM3+NK细胞（p<0.05）,但在缓解SAA患者NKG2A,NKp46,NKp44及穿孔素的表达在TIM3^—NK及TIM3⁺NK两群细胞比较无明显差异（p>0.05）。正常对照组TIM3^—NK细胞比TIM3⁺NK细胞表达更高的NKG2D及颗粒酶B（p<0.05）,而TIM3^—NK细胞抑制性受体NKG2A表达水平明显低于TIM3⁺NK细胞（p<0.05）,但在正常对照组CD158a,CD158b,NKp46,NKp44及穿孔素的表达在TIM3^—NK及TIM3⁺NK两群细胞比较无明显差异（p>0.05）。初治、缓解SAA组及正常对照三组TIM3^—NK和TIM3⁺NK功能分子两两比较,SAA患者TIM3⁺NK细胞NKP44表达水平高于正常对照组（p<0.05）,而SAA患者TIM3^—NK细胞NKP44,NKP46及穿孔素的表达水平高于正常对照组（p<0.05）,三组TIM3⁺NK和TIM3^—NK其他功能分子表达无统计学差异（p>0.05）。2.SAA患者TIM3⁺NK细胞及TIM3^—NK细胞分别与mDC细胞共同孵育,流式检测TIM3^—NK细胞孵育组及TIM3⁺NK细胞孵育组mDC细胞CD80及CD86表达水平明显低于未孵育组,特别是TIM3-NK细胞孵育组mDC细胞CD80及CD86表达水平明显低于TIM3⁺NK细胞孵育组,三组比较有统计学差异（p<0.01）。3.SAA患者TIM3⁺NK细胞及TIM3^—NK细胞分别与Treg细胞共同孵育,流式检测TIM3^—NK细胞孵育组Treg细胞CTLA4及CD39表达水平略高于TIM3⁺NK细胞孵育组及未孵育组,但差异无统计学意义（p>0.05）。4.SAA患者TIM3⁺NK细胞及TIM3^—NK细胞分别与K562细胞共同孵育,K562细胞凋亡率明显升高,特别是与TIM3^—NK细胞共孵育后凋亡率升高更明显,且高于TIM3⁺NK细胞共孵育组,差异有统计学意义（p<0.01）。5.SAA患者TIM3^—NK细胞受体后信号通路蛋白AKT水平与TIM3⁺NK细胞相比无明显差异,而TIM3^—NK细胞受体后信号通路蛋白P-AKT水平明显高于TIM3⁺NK细胞。6.SAA初治组NK细胞T-bet mRNA及Eomes mRNA相对表达量较正常对照有升高趋势,但无统计学意义（p>0.05）。第三部分:1.成功构建免疫介导的SAA小鼠模型。FCM检测SAA小鼠NK细胞TIM3表达水平明显低于正常小鼠及TBI小鼠（p<0.05）,但正常与TBI小鼠无差别（p>0.05）。SAA小鼠TIM3⁺NK及TIM3^—NK细胞表面抑制性受体NKG2A表达无明显差别（p>0.05）,而TIM3^—NK细胞活化性受体NKG2D水平明显高于TIM3⁺NK细胞（p<0.05）。SAA小鼠TIM3^—NK细胞受体后信号通路蛋白AKT水平与TIM3⁺NK细胞相比无明显差异,而TIM3^—NK细胞P-AKT、PI3K水平明显高于TIM3⁺NK细胞（p>0.05）。以上结果提示SAA小鼠NK细胞TIM3表达水平减低,且TIM3^—NK细胞功能活性高于TIM3⁺NK细胞。2.造模第17天,SAA小鼠体重及血象、骨髓象均明显低于NC组（p<0.05）,CsA治疗组,TIM3⁺NK及TIM3^—NK细胞输注治疗组,CsA联合TIM3^—NK细胞输注治疗组,CsA联合TIM3阻断剂治疗组对SAA小鼠体重、血象及骨髓象均有一定改善,单独TIM3阻断剂治疗小鼠稍有改善,疗效不显著,与CsA联合使用无明显协同作用,TIM3^—NK细胞输注治疗组疗效优于TIM3⁺NK细胞输注治疗组,TIM3^—NK细胞输注联合CsA治疗较单独CsA治疗疗效更显著,与CsA可能有一定协同作用。结论1.SAA患者外周血NK及CD56^dim NK细胞TIM3表达率减低,TIM3表达越低,SAA患者病情越重,IST治疗后缓解患者TIM3表达水平可达到正常水平,虽然初治SAA患者NK细胞TIM3 mRNA相对表达量低于正常人,但无统计学差异。2.SAA患者TIM3^—NK细胞活化性功能分子表达及杀伤活性明显高于TIM3⁺NK细胞,体外培养发现TIM3^—NK可以抑制mDC功能及促进K562细胞凋亡,生物活性高于TIM3⁺NK细胞。TIM3低表达可以增强NK细胞功能,抑制SAA患者免疫激活状态,TIM3分子的降低可能参与了SAA早期的发病,可能为SAA潜在的治疗靶点。3.AA小鼠模型NK细胞TIM3表达减低,且TIM3^—NK细胞功能活性强于TIM3⁺NK细胞,与SAA患者NK细胞TIM3减低及TIM3^—NK细胞功能活性增强趋势一致。予以TIM3^—NK细胞回输治疗后,SAA小鼠一般状况、血细胞及骨髓细胞计数均有改善,联合CsA治疗疗效更好。本研究进一步补充了SAA的免疫发病机制理论并为提高SAA疗效提供了新思路。