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电压门控钠离子通道亚型Nav1.7和Nav1.8参与炎症性和神经病理性疼痛的调节,是治疗慢性疼痛的新型药物靶点。Nav1.7和Nav1.8的抑制剂显示优于吗啡的镇痛活性,然而其非专一性的靶点活性产生严重的副作用。作用于疼痛相关钠通道专一性抑制剂的筛选和结构与功能的研究,有助于新型镇痛药物先导分子的研发和利用专一性多肽探针探究钠离子通道参与疼痛的调节。中华眼镜蛇（Naja atra）,属眼镜蛇科,主要分布于我国南方地区。本课题成功从中华眼镜蛇毒液分离纯化出Nav1.8抑制剂,命名为μ-EPTX-Na1a（Na1a）。电喷雾质谱鉴定和Edamn降解测序结果显示,Na1a相对分子质量为7053.63 Da,由62个氨基酸残基组成,含有8个半胱氨酸。结构预测符合典型的蛇毒毒素的三指结构模型,8个半胱氨酸组成的4对二硫键连接方式为I-III、II-IV、V-VI和VII-VIII。大鼠背根神经节（DRG）细胞上河豚毒素不敏感型（TTX-R）钠通道活性检测,Na1a显示对Nav1.8的强抑制活性,IC50为167 nM,1μM的浓度几乎能够抑制全部的Nav1.8钠电流。对DRG上河豚毒素敏感型（TTX-S）钠通道和非失活的Nav1.9活性检测,10μM的Na1a仅具有较弱的抑制活性。检测Na1a对DRG上Nav1.8电生理特性的影响,200 nM Na1a使得Nav1.8的最大激活电压向去极化方向漂移约+10 mV,同时使稳态激活向去极化方向漂移约+11 mV,使稳态失活的向超极化方向漂移约9 mV。洗脱实验显示Na1a能快速结合靶点通道,具有稳定结合活性,同时能够被洗脱。钠离子通道亚型选择性实验结果显示,Na1a能够抑制ND7/23细胞上表达的Nav1.8,IC50为386 nM,10μM的Na1a对Nav1.3,Nav1.7和海马神经元TTX-S钠通道（Nav1.1-1.3）具有较弱抑制活性,10μM Na1a抑制Nav1.4电流约48%,对Nav1.5有抑制作用,IC50为8.51μM,该结果显示Na1a具有较高的专一性。药效学活性实验,Na1a在醋酸扭体疼痛模型,福尔马林疼痛模型和完全弗氏佐剂疼痛模型上具有强于吗啡的镇痛活性,在热板疼痛模型和坐骨神经结扎模型上均具有类似于或略优于吗啡的镇痛活性。同时对Na1a的副作用进行评价:运动功能,30倍镇痛剂量腹腔注射小鼠显示其对其游泳运动时间无明显影响;心脏毒性,对SD新生大鼠心肌Nav1.5的毒性实验显示1μM Na1a约抑制15%的电流;溶血活性和细胞毒活性,35μM浓度下均无两种副作用的表现;心脏安全性评价,10μM Na1a抑制hERG通道电流约为18%。酿酒酵母表达体系成功获得Na1a的异源制备。Na1a的靶点专一性,显著的镇痛活性,弱副作用反应和成功异源制备使其成为一个具有巨大潜力的镇痛药物先导分子。海南捕鸟蛛（Haplopelma hainanum）,属捕鸟蛛科,一种主要分布在我国海南省通什县山区的毒性很强的大型蜘蛛。本课题成功地从海南捕鸟蛛毒液中筛选得到Nav1.8的专一性延缓失活剂,命名为δ-TRTX-Hhn1a（Hhn1a）。质谱鉴定和Edamn降解测序结果显示,Hhn1a相对分子质量为3977.62 Da,由34基酸残基组成,含有6个半胱氨酸。结构预测符合抑制剂半胱氨酸节（ICK）模体,6个半胱氨酸组成的3对二硫键连接方式为I-IV,II-V和III-VI。大鼠DRG细胞钠通道活性检测,0.5μM Hhn1a抑制DRG上Nav1.8的峰电流,而2μM Hhn1a则延缓Nav1.8的失活。Hhn1a能够抑制DRG上TTX-S钠离子通道,IC50为4.1μM。亚型选择性结果显示:对异源表达的Nav1.8,Hhn1a同样表现为低浓度抑制峰电流和高浓度延缓失活的特性;对Nav1.3、Nav1.4、Nav1.5和Nav1.7均表现为抑制活性,IC50分别为3.1±0.08μM、4.2±0.08μM、5.8±0.06μM和2.9±0.03μM。亚型选择性实验证实Hhn1a为Nav1.8的专一性延缓失活剂。Hhn1a可用于探究Nav1.8参与疼痛信号通路调节的分子机制有待进一步探究。海南捕鸟蛛是我国海南省特有的大型剧毒蜘蛛,本实验室在该蜘蛛毒液中发现多种具有重要药理学活性的多肽分子。分析海南捕鸟蛛毒腺的cDNA文库发现,Nav1.7专一性抑制剂μ-theraphotoxin-Hhn2a（HNTX-III）的家族多肽在两个位点存在高突变,即Tyr20突变为His,Ser24突变为Asn。通过色谱分离技术和质谱检测,不能检测到该突变体的天然存在,而HNTX-III在毒液中的含量则可达到1%,这种基因水平存在的天然突变体的生物学活性如何以及其存在的生物学意义是什么。同时,同属HNTX-III家族的HNTX-I,Nav1.7弱抑制活性的HNTX-I的第26位酸性残基组氨酸与强抑制活性的HNTX-III相比突变为碱性天冬氨酸残基,是否这一突变改变HNTX-I对Nav1.7的抑制活性。本实验通过固相化学方法合成了HNTX-III和四个突变体HNTX-III-Y20H,-S24N,-H26D,-Y20H/S24N。通过氧化折叠使得二硫键配对,圆二色谱结果检测显示四个突变体CD谱吸收曲线与HNTX-III基本重叠,表明突变没有明显改变其二级结构。因而,正确二级结构的HNTX-III和四个突变体成功制备。本课题检测5个多肽分子对DRG上TTX-S,TTX-R钠离子通道的活性,以及对异源表达钠通道亚型Nav1.3-1.5,Nav1.7,Nav1.8的活性。结果表明,HNTX-III及其天然突变体对TTX-R钠离子通道无抑制活性,对TTX-S钠离子通道具有不同程度的抑制活性。其中,HNTX-III及其突变体HNTX-III-Y20H,-S24N,-H26D,-Y20H/S24N对DRG细胞上TTX-S钠通道的IC50分别为0.044μM,4.37μM,0.138μM,2.6μM和1.95μM。因而,Y20,S24,H26的突变降低对DRG TTX-S钠通道的亲和性分别为99.3倍,3.14倍,61.1倍,而双突变-Y20H/S24N降低亲和力仅为44.3倍。对钠离子通道亚型Nav1.7的抑制活性检测显示,HNTX-III及其突变体HNTX-III-Y20H,-S24N,-H26D,-Y20H/S24N的IC50分别为0.15μM、9.56μM、1.28μM、7.58μM和2.99μM,因而,Y20,S24,H26和-Y20H/S24N的突变分别降低亲和力为62、8.4、4.9和19.5倍。Nav1.3的抑制活性检测显示,HNTX-III的IC50为0.89μM,突变体-S24N,-Y20H/S24N的IC50则为6.31μM和10.72μM,分别降低7倍和12倍,HNTX-III-Y20H,-H26D则在50μM浓度分别抑制Nav1.3峰电流43%和49%。另外,对Nav1.4,Nav1.5和Nav1.8的抑制活性检测,HNTX-III和四个突变体在10μM浓度下均无抑制活性。同时对分别检测了HNTX-III和四个突变体对DRG-TTX-S钠通道,Nav1.7和Nav1.3的I-V,激活和失活的影响,发现均无显著改变。突变体活性的显著差异表明Try20,Ser24和His26是HNTX-III抑制钠通道的关键残基。HNTX-III的三维结构解析证实了这一结果。综上结果推测,自然选择帮助和保留了最强抑制钠离子通道活性的毒液主要组分HNTX-III,用以防卫和捕食。同时,HNTX-III的三维结构数据的测定和分析,表明其结合钠离子通道的关键残基位于C末端的2个活性区域,为基于结构和活性位点的分子改造和靶点药物设计提供了良好的的前期研究。