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肠球菌是人类胃肠道和女性泌尿生殖道的正常菌群,属条件致病菌,广泛的存在于人体和自然环境中,可引起尿路感染、皮肤软组织感染,对免疫力低下者可致严重感染,如心腹腔感染、内膜炎、菌血症和脑膜炎等。近年来,肠球菌成为院内重要的感染源。在肠球菌感染病例中,粪肠球菌占绝对多数,约85%-90%,屎肠球菌占5%-10%,其余的肠球菌(如坚韧肠球菌、铅黄肠球菌、鹑鸡肠肠球菌、鸟肠球菌)很少有报道。对于肠球菌严重感染临床上常选用作用于细胞壁的药物与氨基糖苷类抗生素联合用药,而高水平庆大霉素耐药(HLGR)使这种协同杀菌作用消失。HLGR主要归因于氨基糖苷类双功能修饰酶(AAC-APH)的存在。AAC-APH基因形成转座子结构(Tn5281),并且多数定位于质粒中,易于转移至非HLGR的菌株中,引起其高水平耐药。完整结构的Tn5281转座子在其AAC-APH基因两侧存在反向重复的插入序列IS256,而肠球菌里发现的截断结构的类Tn5281转座子表现为双功能修饰酶基因一端或者两端缺失插入序列IS256。IS256属于一个大的家族,其成员在革兰氏阳性菌和阴性菌中均有分布。已有研究发现IS256插入序列可激活葡萄球菌耐药基因的转录,并且有报道显示IS256与表皮葡萄球菌庆大霉素耐药有显著相关性,因此我们推测作为双功能修饰酶转座子结构一部分的IS256与肠球菌庆大霉素耐药性存在关系,并且很可能与双功能修饰酶耐药基因的转移相关。据此,本论文选取2006-2009年北京地区临床分离肠球菌来研究IS256在双功能修饰酶耐药基因转移中的作用。首先通过高水平庆大霉素耐药(HLGR)筛选、双功能修饰酶基因(aac-aph)检测等分离出HLGR且aac-aph阳性菌株或非HLGR且aac-aph阴性菌株。对于HLGR月aac-aph阳性者,PCR检测确定其转座子结构及菌株内是否存在IS256基因,将菌株分为H1-H6组,为接合转移实验的供体菌库；而对于非HLGR且aac-aph阴性组,PCR检测菌体内IS256存在与否,将菌株分为NH1和NH2组,然后自发突变或诱导突变制备夫西地酸、利福平耐药株,作为接合转移实验的受体菌库。采用滤膜法进行供体菌库菌株与JH2-2,HH22与受体菌库菌株,供体菌库菌株与受体菌库菌株间的接合转移实验,计算接合转移效率。依据接合转移成功率、接合转移效率与IS256在供体菌和受体菌的存在状况来系统评判IS256在双功能修饰酶耐药基因转移中的作用。研究中我们共测定了2006-2009年北京地区169株临床分离粪肠球菌和21株临床分离屎肠球菌的高水平庆大霉素耐药性、双功能修饰酶耐药基因及其转座子结构、IS256存在状况。结果显示,169株粪肠球菌中,111株(65.7%)为HLGR株,而且HLGR菌中97.3%含有双功能修饰酶基因aac-aph,其中10.2%含有完整结构的转座子(aac-aph两端均含有IS256插入序列),89.8%含有截断结构的转座子(缺失一端或两端的插入序列)。21株屎肠球菌中,15株(71.4%)为HLGR株,而且所有HLGR菌株均含有aac-aph,其中133%含有完整结构的转座子,86.7%含有截断结构的转座子。对插入序列IS256检测结果显示,HLGR菌株中,IS256的检出率为47.6%,而非HLGR菌株中,IS256的检出率仅为9.4%。滤膜法接合转移实验结果显示,108株HLGR且aac-aph阳性粪肠球菌作为供体菌与JH2-2进行接合转移实验时,42株菌株将aac-aph基因转移至粪肠球菌JH2-2中,转移成功率为38.9%。其中H1组为9/57(15.8%),H2组为1/3(33.3%),H3组为1/4(25.0%)；H4组为9/16(56.3%)；H5组为13/17(76.5%)；H6组为9/11(81.8%)。IS256阴性菌株H1+H2组的总转移成功率为10/60(16.7%),IS256阳性菌株H3+H4+H5+H6组的总转移成功率为33/48(68.8%)；两端缺失插入序列的H1+H2+H3组的总转移成功率为11/64(17.2%),一端缺失插入序列的H4+H5组的总转移成功率为22/33(66.7%),完整转座子H6组的转移成功率为9/11(81.8%)。以上结果表明供体菌中IS256的存在有助于接合转移的成功,并且转座子中IS256存在与否对接合转移成功率的影响为：完整结构转座子接合转移成功率>一端缺失插入序列转座子>两端缺失插入序列转座子。而接合转移效率的结果(经接合转移质控对HH22::JH2-2标准化后的数据)显示,完整结构转座子的接合转移效率(H6组,1.29×10-2～6.84×102)>两端均完全缺失IS256的转座子的接合转移效率(H1组,1.78×10-3～6.21×101；H3组,1.02×100)>一端存在或部分存在IS256的转座子的接合转移效率(H2组,1.30×10-3；H4组,1.32×10-3～1.85×10-1;H5组,1.30×10-3～5.46×100)。12株(11株IS256阴性,1株IS256阳性)非HLGR且aac-aph阴性粪肠球菌作为受体菌与HH22进行接合转移实验时,2株菌株(均为IS256阴性)接合转移成功。4株HLGR且aac-aph阳性临床分离粪肠球菌作为供体菌将aac-aph转移至临床分离受体菌08-15和／或08-20中,说明在一定条件下,双功能修饰酶耐药基因可在临床分离菌株之间传播。2006-2009年北京地区临床分离肠球菌HLGR率高,并且绝大多数HLGR肠球菌含aac-aph,通常形成截断结构的转座子。受试粪肠球菌转座子中双功能修饰酶基因两端IS256的存在有助于提高接合转移的成功率和转移效率。