白藜芦醇拮抗卵泡颗粒细胞氧化应激作用的研究

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目的:探讨白藜芦醇对过氧化氢(H2O2)诱导的人卵泡颗粒细胞氧化应激损伤是否具有拮抗作用。方法:1. 收集在河北医科大学第四医院行IVF/ICSI助孕患者取卵后废弃的卵泡液,通过密度梯度离心的方法收集其中的颗粒细胞并进行原代细胞培养。2. 采用CCK-8法测定不同浓度H2O2处理后的细胞存活率,并绘制生存曲线,取IC50浓度建立颗粒细胞氧化损伤模型。3.将培养后的颗粒细胞分为4组:(1)对照组:未做任何处理。(2)损伤模型组:加入IC50浓度的H2O2。(3)10μmol/L白藜芦醇组:加入10μmol/L白藜芦醇和IC50浓度的H2O2。(4)50μmol/L白藜芦醇组:加入50μmol/L白藜芦醇和IC50浓度的H2O2。4.采用CCK-8法测定各组细胞活性。采用硫代巴比妥酸(TBA)法测定丙二醛(MDA)含量,WST-1法测定超氧化物歧化酶(SOD)水平。采用酶联免疫吸附实验测定孕酮(Pg)分泌量。采用流式细胞技术,碘化丙啶(PI)单染法测定细胞周期,Annexin V-FITC/PI双染法测定细胞凋亡率。采用Western Blotting方法测定Bcl-2、Caspase-3和SIRT1的蛋白表达情况。结果:1.根据细胞生存曲线,所得IC50值为65.72μmol/L,并使用此浓度建立颗粒细胞氧化损伤模型。2.与对照组比较,损伤模型组的细胞存活率、SOD水平和Pg分泌量均明显降低,细胞周期表现为sub G1峰增高,G1/G0期和G2/M期的细胞数量明显减少,MDA含量、细胞凋亡率和Caspase-3的蛋白表达量均明显增高,Bcl-2的蛋白表达量明显降低(P<0.05)。3.10μmol/L白藜芦醇组与损伤模型组比较,各指标均无统计学差异(P>0.05)。4.50μmol/L白藜芦醇组:与损伤模型组相比,细胞存活率、SOD水平和Pg分泌量均明显升高,MDA含量明显降低,细胞周期中sub G1峰明显下降、G1/G0期和G2/M期细胞数量明显增加,细胞凋亡率和凋亡蛋白Caspase-3的蛋白表达量均明显降低,凋亡调节蛋白SIRT1和抗凋亡蛋白Bcl-2的蛋白表达量均明显增高(P<0.05)。与对照组相比,细胞存活率、SOD水平、Pg分泌量、Bcl-2蛋白表达量均明显降低,MDA含量、凋亡率、Caspase-3蛋白表达量均明显升高(P<0.05),而细胞周期中sub G1、G2/M期细胞数量两组间无统计学差异(P>0.05),G1/G0期细胞数量明显降低(P<0.05)。结论:1.原代黄素化-卵泡颗粒细胞培养条件较为苛刻,需要通过增加接种密度和较长时间的培养才能达到实验要求。2. H2O2诱导卵泡颗粒细胞建立氧化应激模型稳定而成功,可以被其他氧化和/或抗氧化研究应用。3. 白藜芦醇作为SIRT1的激动剂,能够改善颗粒细胞的功能,增强颗粒细胞的抗氧化能力及抗凋亡能力,为进一步开展体内抗氧化研究提供了实验依据。
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