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脊髓损伤(Spinal cord injury，SCI)导致损伤平面以下截瘫的康复是神经科学界之难题，目前仍无有效的治疗方法。近年来的实验研究表明，给予外源性神经营养因子(Neurotrophic factors，NTFs)可促进创伤后神经的修复和再生。但由于NTFs分子量较大不能透过血脑屏障且半衰期短、生产费用高，因此一直无法应用于临床。 睫状神经营养因子(Ciliary neurotrophic factor，CNTF)是一个具有200个氨基酸残基的酸性蛋白质，因其最初是由Barbin从鸡的睫状神经节中提取出来、并具有维持副交感神经节的活性而得名。体内及体外实验均表明，它能促进多种神经元包括发育中的感觉神经元、交感神经元、睫状神经元和运动神经元的存活、分化和基因表达；还能促进成熟神经元的功能维持。当中枢和外周神经系统受到损伤时，胶质细胞--雪旺氏细胞和星形胶质细胞分泌表达CNTF增加，提示了CNTF有减轻神经细胞的变性坏死的作用。研究已证实，CNTF可促进体外培养的脊髓前角运动神经元的存活和突起生长；在脊髓损伤后白质区胶质细胞表达CNTF与灰质中运动神经元表达受体均增加。所以将外源性CNTF作为一种潜在的治疗因子，直接导入损伤脊髓的周围治疗脊髓损伤引起了医学界的极大关注。 本研究通过体外培养脊髓神经元和星形胶质细胞和小胶质细胞，应用四唑溴盐(MTT)比色法、活体观察和免疫细胞化学染色法研究CNTF对脊髓神经元、星形胶质细胞和小胶质细胞的存活、增殖与分化等的营养作用；通过建立大鼠急性脊髓打击损伤模型，采用辣根过氧化酶(Horseradish peroxidase，HRP)束路追踪法、观察经蛛网膜下腔给予CNTF蛋白对逆行性红核神经元(Red nucleus，RN)损伤的影响；用组织学苏木精-伊红(Hematoxylin and eo-sin，H-E)染色、免疫荧光染色等技术，观察CNTF对损伤脊髓局部神经组织的作用和对反应性胶质细胞增生的影响；另外，运用行为学评分观察CNTF对脊髓损伤后大鼠后肢运动功能恢复的影响。 本研究主要结果如下： (1)10ng／mlCNTF对脊髓神经元的营养作用最佳：体外分离培养小鼠脊髓神经元，据MTT比色法绘制了CNTF的量效曲线，曲线呈“抛物线型”。CNTF在0.01 ng／ml时就能促进脊髓神经元的存活，与对照组相比有统计学意义(P〈0.05)。CNTF在10ng／ml时，其促神经元存活作用达到最大。根据CNTF促进脊髓神经元存活的量效曲线，在观察CNTF对神经元的营养作 中文摘要 用时采用 10ng／ml的浓度。 （2）CNTF能促进体外培养神经元的存活和分化：接种 7天后，通过活体 观察和神经元特异性烯醇化酶（Neuron－specific enolase，NSE）免疫细胞化学 染色法发现CNTF组神经元上的生长锥出现比对照组早，平均每个神经元上 的生长锥数目多（Pwto．01）；CNTF组的神经元存活数目较多、胞体较大而且 突起增粗增多，染色反应深；而对照组神经元出现核偏位、胞体虽大但不够饱 满，染色反应浅，两组相差显著（Pwto．05）。这提示 CNTF能促进体外培养的 神经元的存活和分化。 （3）CNTF可促进体外培养的胶质细胞的存活和增殖：体外分离培养大鼠 脊髓星形胶质细胞和小胶质细胞，分别经胶质纤维酸性蛋白（Glial fibrilary acldic protein，GFAP）、宁）体C3受体（Complement type 3 recepter，OX－42）免 疫荧光染色鉴定纯度大于 97％；通过 MTT法发现 CNTF约在 100ng／ml时， 其促胶质细胞存活效应达到最大。通过活体观察和 5－澳脱氧尿普（5－bromo－ 2－deoxyuridne，BrdU）免疫荧光染色标记分裂细胞发现CNTF组胶质细胞 增殖率高于对照组（P＜0．05入 （4）CNTF可减轻脊髓损伤所致的逆行性红核运动神经元的变性坏死：制 备大鼠急性脊髓中度打击损伤模型，经蛛网膜下腔向损伤区（T10）隔日注射 CNTF蛋白 10mg（连续 10天）。至损伤后 6周时用辣根过氧化酶（HRP）束路 追踪发现：①损伤后生理盐水（SAL）组与CNTF组红核神经元标记数与假手 术组相比均有显著减少（Prto．01）；③CNTF组比SAL组细胞标记数目多， 细胞形态好，存活率高（P＜0．of）。这提示 CNTF能减少脊髓损伤所致的逆 行性红核运动神经元的变性死亡数目，减轻逆行性损伤。 （5）CNTF能减轻局部组织的继发性损伤和促进反应性胶质细胞增生：制 备大鼠急性脊髓中度打击损伤模型，经蛛网膜下腔隔日向损伤区（T10）注射 CNTF蛋白 10mg（连续 10天），组织学和免疫荧光显示：①在 TS－T12节段 CNTF组保留剩余组织较SAL组多（P＜0．05）；②CNTF组GFAP和OX－42 免疫阳性细胞数目较 SAL组明显增多（Pwto．01）。这?