第一部分鱼藤酮诱导SH-SY5Y细胞帕金森病模型的建立第一节鱼藤酮对SH-SY5Y细胞的影响目的研究鱼藤酮对人神经母细胞瘤细胞SH-SY5Y的影响。方法观察鱼藤酮处理后SH-SY5Y细胞形态变化,采用MTT比色法检测鱼藤酮处理对细胞活力的影响,选定鱼藤酮干预浓度；采用吖啶橙(AO)/溴化乙锭(EB)双荧光染色,在荧光显微镜下观察细胞死亡方式并计算细胞凋亡率。结果鱼藤酮处理后SH-SY5Y细胞形态改变明显,生长受到抑制,神经元突起变短减少,部分细胞圆缩,细胞贴壁能力降低；MTT结果提示,鱼藤酮可浓度依赖性和时间依赖性的降低SH-SY5Y细胞活力；AO/EB双荧光染色显示,鱼藤酮诱发SH-SY5Y细胞的死亡方式以凋亡为主,并时间依赖性和浓度依赖性诱发细胞凋亡。结论鱼藤酮能够时间依赖性和浓度依赖性诱导SH-SY5Y细胞凋亡。第二节鱼藤酮诱导未分化SH-SY5Y细胞PD模型的建立目的观察鱼藤酮诱导后SH-SY5Y细胞内包涵体的形成及α-突触核蛋白的表达和定位改变。方法HE染色观察鱼藤酮处理SH-SY5Y细胞24h和48h后细胞形态变化及包涵体形成；激光共聚焦荧光显微镜观察鱼藤酮诱导后α-突触核蛋白(a-synuclein)的分布和性状改变；蛋白免疫印迹分析(Western blot)检测鱼藤酮对SH-SY5Y细胞内a-synuclein蛋白表达水平的影响。结果HE染色,光镜下见鱼藤酮处理后SH-SY5Y细胞胞体和胞核明显增大,突起变短减少,胞质疏松、空泡化,出现核固缩,胞浆内观察到嗜伊红、边界清楚的类路易小体样包涵体；a-synuclein和ThioflavinS双荧光染色,在激光共聚焦显微镜下观察,细胞内出现颗粒状a-synuclein免疫染色阳性聚集体,可被Thioflavin S共定位；Western blot检测到鱼藤酮诱导后细胞内a-synuclein表达上调。结论鱼藤酮诱导SH-SY5Y细胞后出现嗜酸性包涵体,a-synuclein和Thioflavin S共免疫染色阳性聚集体,及诱发a-synuclein蛋白表达升高,提示鱼藤酮诱导SH-SY5Y细胞能够很好模拟PD病理特征,能够作为神经毒素成功建立PD细胞模型。第二部分鱼藤酮诱导的SH-SY5Y细胞PD模型中GAPDH表达、分布的变化第一节鱼藤酮对SH-SY5Y细胞中GAPDH表达、亚细胞定位的影响目的研究鱼藤酮对SH-SY5Y细胞内GAPDH的表达、亚细胞定位的影响。方法使用免疫荧光染色激光共聚焦显微镜观察细胞内GAPDH的分布和亚细胞定位改变；采用蛋白免疫印迹分析(Western blot)和实时荧光定量PCR(real-time PCR)技术检测鱼藤酮对SH-SY5Y细胞内GAPDH蛋白和mRNA表达水平的影响。结果免疫染色激光共聚焦结果显示,鱼藤酮处理后,SH-SY5Y细胞胞浆内GAPDH染色荧光增强,且出现GAPDH染色阳性颗粒样聚集体,部分细胞胞核内GAPDH分布增多。而正常组SH-SY5Y细胞内GAPDH蛋白在胞浆中均匀分布,胞核内仅有少量分布。Western blot及real-time PCR结果分析显示,鱼藤酮处理后细胞内GAPDH蛋白和mRNA水平随着处理时间延长逐渐升高。结论PD细胞模型中,鱼藤酮可以导致GAPDH亚细胞定位及性状改变,诱发GAPDH的过表达和异常聚集,这可能是神经元凋亡及包涵体形成的重要机制之一。第二节鱼藤酮诱导后SH-SY5Y细胞核中GAPDH定位及表达变化目的探讨鱼藤酮诱导SH-SY5Y后胞核内GAPDH定位及表达变化。方法鱼藤酮诱导SH-SY5Y细胞后免疫荧光染色,使用激光共聚焦显微镜观察细胞内GAPDH的表达和定位改变；同时采用免疫组织化学染色观察鱼藤酮诱导对GAPDH的影响；提取细胞核蛋白,采用蛋白免疫印迹分析(Western blot)检测细胞核内GAPDH的表达变化。结果免疫荧光激光共聚焦结果显示,正常细胞内GAPDH蛋白均匀分布于细胞浆,胞核区仅有少量分布,鱼藤酮处理48h后,部分细胞的胞核区GAPDH荧光染色增强、浓聚。免疫组化染色光镜下观察到鱼藤酮处理后细胞GAPDH染色增强,部分细胞核呈浓染棕色,与免疫荧光染色结果一致。Western blot结果也显示,随着鱼藤酮处理浓度增大细胞核内GAPDH的表达量逐渐升高,呈浓度依赖性。以上结果提示GAPDH发生了核转位。结论鱼藤酮可以导致GAPDH发生核转位,随着处理时间延长和处理浓度增大,GAPDH的核转位增加,提示GAPDH核转位可能是鱼藤酮诱导神经元凋亡的重要机第三部分GAPDH胞浆聚集和核转位在鱼藤酮诱导的PD细胞模型中的作用机制第一节GAPDH异常降解对鱼藤酮诱导后SH-SY5Y细胞的影响目的探讨泛素蛋白酶体途径和自噬溶酶体途径在GAPDH蛋白降解中的作用。方法采用MTT比色法检测不同药物(鱼藤酮、MG132、3-MA、Rapamycin和MgCl2)干预对SH-SY5Y细胞活力的影响,选择药物干预浓度；通过选择性抑制和激活泛素蛋白酶体途径和自噬溶酶体途径两条降解通路,采用蛋白免疫印迹分析(Western blot)检测鱼藤酮诱导后细胞内GAPDH蛋白水平变化。结果鱼藤酮处理后细胞内GAPDH蛋白水平上调,加入蛋白酶体抑制剂MG132和自噬溶酶体途径抑制剂3-MA后细胞内GAPDH上升更明显,与对照组比较差异显著(P<0.05),说明两条途径被抑制后增加了细胞内GAPDH的含量；加入蛋白酶体促进剂Mg2+和溶酶体途径激活剂Rapamycin后细胞内GAPDH水平下调,低于单独鱼藤酮处理组,Mg2+组GAPDH下降更明显,与单独鱼藤酮处理组比较差异显著(P<0.05),说明两条途径被激活均可减少细胞内GAPDH的含量。结论GAPDH不仅通过泛素蛋白酶体途径降解,也通过自噬溶酶体途径降解。其中泛素蛋白酶体途径可能在GAPDH的降解中起更重要的作用。激活两条降解通路能够下调GAPDH,可能为神经保护和PD治疗提供新的方向和靶点。第二节Siahl参与鱼藤酮诱导的GAPDH核转位及其下游机制目的探讨Siahl在GAPDH核转位中的作用及其促凋亡作用。方法采用免疫荧光染色激光共聚焦显微镜观察鱼藤酮诱导SH-SY5Y细胞后细胞内GAPDH和Siahl的表达和定位改变；使用蛋白免疫印迹分析(Western blot)检测细胞核内Siahl的表达变化,分析其与GAPDH核转位的相关性。采用Western blot检测鱼藤酮诱导多巴胺能神经元的促凋亡作用。结果鱼藤酮处理组细胞的胞浆和胞核中GAPDH和Siahl的荧光强度均较对照组增强,两者共聚焦后胞浆呈明亮黄色,胞核中也出现黄色荧光。Western blot结果也显示鱼藤酮诱导后胞核中Siahl表达呈浓度依赖性增加,与GAPDH变化趋势一致。鱼藤酮诱导后凋亡相关蛋白总p53和线粒体凋亡途径相关蛋白Bax也呈浓度依赖性升高。结论Siahl参与了鱼藤酮诱导的GAPDH核转位,两者可能在胞浆中结合,由胞浆向胞核发生转位,发挥促凋亡作用。第三节RNA干扰Siah1表达对鱼藤酮诱导后GAPDH核转位的影响目的研究RNA干扰对Siah1的表达以及对鱼藤酮诱导的GAPDH核转位的影响。方法使用脂质体Lipofectamine2000将针对Siah1基因的siRNA转染进入SH-SY5Y细胞中,使用蛋白免疫印迹法(Western blot)鉴定干扰效果；鱼藤酮处理未干扰组和干扰组SH-SY5Y细胞,提取细胞核蛋白,采用Western blot检测鱼藤酮诱导后未干扰组和干扰组细胞核内GAPDH的表达变化。结果蛋白免疫印迹结果分析显示,化学合成的siRNA可有效抑制细胞内Siah1蛋白表达；鱼藤酮能够引起SH-SY5Y细胞内GAPDH发生核转位,干扰Siah1后可减少鱼藤酮所致的GAPDH核转位。结论RNA干扰Siah1表达可减少鱼藤酮诱发的GAPDH核转位,说明Siah1参与了GAPDH由胞浆向胞核转位的运动机制；减少GAPDH核转位可降低细胞凋亡,提示对Siah1进行干扰可能发挥神经保护作用。