副鸡禽杆菌外膜蛋白gcbG的原核表达及荚膜转运基因HctC缺失株的构建

来源 :新疆农业大学 | 被引量 : 0次 | 上传用户:hanqianghuoer
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鸡鼻炎是由副鸡禽杆菌引起的以鸡肿头肿脸为主要症状的急性呼吸道传染病,主要引起育成鸡生长发育受阻和淘汰率增加,且造成蛋鸡产蛋量明显下降,给我国养禽业造成了巨大损失。因此,进行Apg新型疫苗的研发,研制出对鸡安全、有效并能迅速产生免疫力的基因工程疫苗为当前研究的主要任务。本研究对B型标准株gcbG基因进行了克隆、测序,大小为495bp,将其插入pGEX-5X-1原核表达质粒中,构建pGEX-5X-gcbG原核表达载体,转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞,获得gcbG蛋白原核表达菌株;对gcbG蛋白进行表达、最佳表达条件的优化以及表达产物的免疫原性分析,结果表明,本实验成功地在体外表达了APg血清B型gcbG蛋白,大小约为44ku,该蛋白在IPTG浓度为1mM/L,温度为28℃,表达时间为5h,表达量最高,且为包涵体表达。纯化gcbG重组蛋白包涵体,进行Westernblotting检测,结果表明,目的蛋白与Apg鸡阳性血清有特异性免疫反应。对B型标准株HctC基因进行了克隆、测序,大小为1164bp,以副鸡禽杆菌标准株0221为实验基础,利用转座子采用定点克隆的方法,扩增其全长片段,将其连入pGEM-T载体,通过反向PCR并反向自连后获得基因缺失片段,将基因缺失片段转入pemoC2自杀质粒构建基因缺失转移载体。在成功构建基因缺失转移载体的基础上,将其电转入副鸡禽杆菌感受态细胞中,通过自杀质粒介导的同源重组方法得到副鸡禽杆菌HctC基因缺失株。结果表明,Apg基因缺失菌株菌体形态与野生菌株无显著差异,生长速度并未受明显影响。
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