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精子发生是一个复杂的生物学过程,这一过程需要生精细胞和睾丸体细胞的协同作用。睾丸生精小管中具有多种细胞,支持细胞作为对睾丸具有重要功能的一种体细胞,可形成血-睾屏障,分泌多种分泌因子,还可以为生殖细胞提供生物学上的支持,如果支持细胞的基因表达调控发生异常,可能会导致精子发生的障碍,从而导致雄性不育。研究表明,microRNAs(miRNAs)对支持细胞的增殖、分泌和凋亡具有一定调控作用。本实验室前期转录组数据分析,发现miRNA-34c和miRNA-449b在初生公牛和成年公牛的睾丸组织中差异表达,我们推测miRNA-34c和miRNA-449b可能在公牛的精子发生过程中具有调控作用,但作用及其机制尚不清楚。本研究构建miRNA-34c和miRNA-449b的干扰和过表达载体,采用EdU和qRT-PCR检测鉴定了miRNA-34c和miRNA-449b对支持细胞增殖和分泌功能的影响,并通过流式细胞术和TUNEL,检测了miRNA-34c和miRNA-449b对牛支持细胞细胞凋亡的影响。结果表明:miRNA-34c和miRNA-449b对睾丸支持细胞均有调控作用,其中:当miRNA-34c过表达以后,支持细胞合成分泌因子GDNF、BMP4、CXCL12和ABP的表达水平降低,支持细胞的增殖受到抑制,并且促进了支持细胞的凋亡,而当miRNA-34c被抑制时,结果相反;当miRNA-449b过表达时,支持细胞合成的分泌因子GDNF、BMP4、CXCL12和ABP表达水平也降低,凋亡水平增加。基于Targetscan和本实验室转录组数据中靶标关系的预测,筛选了潜在靶基因受体酪氨酸激酶(AXL)。构建了包含AXL基因3’UTR区域潜在与miRNA-34c和miRNA-449b存在结合位点的野生型(WT)和突变型(mut)的双荧光素载体。双荧光素酶报告实验、qRT-PCR和western blot结果显示,当miRNA-34c和miRNA-449b过表达时AXL基因的表达水平显著降低(p<0.05),当miRNA-34c和miRNA-449b被抑制时,AXL表达量升高(p<0.05);转染野生型的荧光素载体的牛睾丸支持细胞中荧光素酶的活性比值显著低于转染突变型的荧光素载体的牛睾丸支持细胞,说明AXL基因是miRNA-34c和miRNA-449b的的直接靶标。此外,构建AXL基因的过表达载体,通过EdU和qRT-PCR验证了AXL基因对支持细胞增殖和分泌功能的调控,并通过流式细胞术检测凋亡细胞和qRT-PCR检测了AXL基因对凋亡基因的影响,PCR-array的方式检测了80个繁殖相关性基因的表达水平变化。结果表明miRNA-34c通过直接靶向AXL基因从而调控牛睾丸支持细胞的增殖分泌和凋亡,miRNA-449b也通过靶向AXL基因调控支持细胞的分泌和凋亡,但是对支持细胞的增殖的影响不显著。本研究揭示了miRNA-34c和miRNA-449b与AXL基因的靶向关系及对牛睾丸支持细胞增殖分泌及凋亡的影响,以及AXL基因对繁殖相关基因表达的调控,提示AXL基因可能通过影响支持细胞相关基因的表达从而间接影响睾丸的发育和精子的发生。