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为了扩大苏云金芽孢杆菌的杀虫谱及生防范围,通过抑真菌和杀虫生物活性测定,从20株几丁质酶活性比较高的Bt菌株中筛选到一株广谱抑真菌并对甜菜夜蛾高效的菌株Bt96519-1。研究了该菌株的抑制真菌孢子萌发活性、菌体及伴孢晶体显微形态、cry基因型等特征并在大肠杆菌中克隆了其参与杀虫和抑真菌的活性物质的编码基因:chiB、vip3A、cry1Ac。
利用对峙法检测了20株Bt菌株的抑真菌活性,通过比较抑菌圈的大小,从中筛选出6株抑菌效果较强的菌株。这6株Bt菌株对8种供试植物病原真菌菌丝生长有不同程度的抑制作用,且对某些真菌的抑制效果能达到3个“+”。通过杀虫生物活性测定从这6株菌株中筛选出两株对棉铃虫、甜菜夜蛾都有较高毒性的96519-1和96519-11菌株。本室的高毒菌株15A3作为生测参比菌株。15A3、96519-1、96519-11对棉铃虫的半致死浓度(LC50)依次为7.8μg/mL、12.8μg/mL、9.2μg/mL,对甜菜夜蛾的半致死浓度(LC50)依次为18.2μg/mL、5.5μg/mL、7.1μg/mL。目前已报道对棉铃虫高效的Bt菌株很多,但对甜菜夜蛾高效的却很少。15A3是公认的对棉铃虫、甜菜夜蛾都很高效的专利菌株,96519-1对甜菜夜蛾的毒力比15A3提高了近3倍。使用杯碟法检测96519-1对供试8种真菌孢子萌发的抑制作用,发现其能完全抑制这些真菌孢子的萌发。因此,96519-1是一株广谱抑真菌并对甜菜夜蛾高效的多功能生防菌株,已完成专利申请。
将在LB培养基上分别培养了8h和72h的96519-1制成涂片,在显微镜下观察其菌体及伴孢晶体形态发现:处于营养生长期的96519-1的菌体呈杆状,一般都是两两连在一起;会形成椭圆形、正方形、菱形及不规则形的晶体。经PCR-RELP分析以及特异引物PCR检测,证明该菌株含有6种杀虫蛋白基因:cry1Aα、cry1Ab、cry1Ac、cry1I,、cry2、vip3A和一种几丁质酶基因chiB。经SDS-PAGE分析,96519-1菌株分别产生分子量大约为135kD、130kD、80kD、65kD、60kD的几种杀虫晶体蛋白,这与对其检出的cry基因型是一致的。
在大肠杆菌XL-Blue中克隆、表达了96519-1编码几丁质酶B基因chiB。通过硫酸铵沉淀,得到ChiB粗蛋白,进行SDS-PAGE电泳分析,发现分子量约为64kD。使用杯碟法检测ChiB粗酶对真菌孢子萌发的抑制作用,发现其在一定的酶活条件下对真菌孢子萌发有明显的抑制作用。
经对96519-1菌株vip3A基因(登录号为Eu541373)测序及序列比对发现:与最相近的vip3A基因存在5个碱基和4个氨基酸的差异。可见96519-1的vip3A基因是个比较新型的基因。