【摘 要】
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目的:判断牙髓炎症程度,识别其可逆与否是活髓切断术成功的关键。本研究利用单细胞拉曼技术对牙龈卟啉单胞菌脂多糖（P.g-LPS）诱导后的牙髓细胞（HDPCs）进行光谱表征,识别炎症细胞胞内发生的具体生化改变,实现牙髓炎症分级。这有助于为牙髓炎症测试提供新的认识,以指导临床判断牙髓炎症程度,从而减少过度治疗,提高活髓保存成功率。方法:（1）组织块培养法培养原代牙髓细胞,免疫组化方法鉴定组织来源后用于后
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目的:判断牙髓炎症程度,识别其可逆与否是活髓切断术成功的关键。本研究利用单细胞拉曼技术对牙龈卟啉单胞菌脂多糖（P.g-LPS）诱导后的牙髓细胞（HDPCs）进行光谱表征,识别炎症细胞胞内发生的具体生化改变,实现牙髓炎症分级。这有助于为牙髓炎症测试提供新的认识,以指导临床判断牙髓炎症程度,从而减少过度治疗,提高活髓保存成功率。方法:（1）组织块培养法培养原代牙髓细胞,免疫组化方法鉴定组织来源后用于后续实验。首先利用CCK-8法记录牙髓细胞正常生长周期,其次,利用单细胞拉曼分选仪在细胞的不同生长阶段分别采集光谱,结合多元统计分析成功区分并预测细胞生长代谢状态。（2）用P.g-LPS诱导HDPCs构建牙髓细胞炎症模型。利用CCK-8方法对P.g-LPS适宜的诱导浓度和时间进行筛选,实时荧光定量聚合酶链式反应法（RT-q PCR）检测各实验组炎症因子IL-6、IL-8的m RNA的相对表达量。（3）拉曼光谱对不同炎症程度的HDPCs进行生物组分变化的无标记表征。比较指纹区(600cm-1-1800cm-1)平均拉曼光谱及差谱,解释差异的生物学意义;结合多元统计分析的方法分别展示P.g-LPS刺激后各实验组和对照组细胞的拉曼数据结构;记录随炎症进展,蛋白质、脂类、核酸三组特征峰的峰值强度变化趋势;基于机器学习支持向量机（SVM）构建分类器,实现炎症分级;将各级炎症细胞换至健康培养基后,再次评估炎症因子相对表达量,明确炎症分级的可逆性阈值。结果:（1）免疫组化染色发现细胞内抗波形丝蛋白（Vimentin）染色阳性,细胞内抗角蛋白（Cytokeratin）染色阴性。这说明原代细胞来源于中胚层组织,符合牙髓组织学特征。（2）HDPCs生长周期包含3个生长阶段:停滞期、指数期和平台期。光谱发生的显著变化:平台期脂质、细胞色素C含量比停滞期和平台期明显增多,而核酸含量下降。PCA散点图中不同生长阶段的细胞表现出清晰的离群现象,并且基于机器学习构建SVM分类器可达到100%的预测准确率。这提示基于拉曼光谱数据结构的特异性可区分并预测不同代谢状态的细胞。（3）P.g-LPS对HDPCs增殖活性有抑制作用且具有时间、剂量依赖性。RT-q PCR结果发现P.g-LPS刺激后细胞内IL-6、IL-8细胞因子m RNA相对表达水平均较对照组显著上调,且差异具有统计学意义（p＜0.05）。（4）比较各组的平均拉曼光谱发现,差异主要表现为特征峰峰值强度而非峰位。PCA-LDA二维散点图显示各组炎症细胞与健康细胞之间具备分离趋势,结合ANOSIM分析证实组间差异大于组内差异。随着炎症的逐级进展,蛋白质归属峰位强度表现出先升高后下降的趋势,脂类和核酸含量呈现出逐渐下降的趋势。当达到损伤等级——V级,细胞内发生的生物学特性改变集中表现为蛋白质和脂类含量的回升,核酸含量的继续下降。基于此构建不同炎症程度细胞预测分类器,分类效果好,预测准确率达到97.37%以上。综合换液后2种炎症因子的表达情况初步判断:I、II级的细胞炎症情况属于亚健康状态,可尝试保留,而III、IV、V级细胞炎症在同样12h的恢复环境中均不可逆转。结论:（1）拉曼光谱技术在不损伤细胞的条件下实时动态地监测细胞分子结构变化,有效区分并预测了不同代谢状态的细胞。（2）通过平均拉曼光谱结合多元统计分析判断各炎症等级的细胞之间是否存在差异,证实拉曼光谱技术区分牙髓炎症程度的潜在可能性。未来可通过更多的拉曼光谱样本构建丰富数据库,从而实现临床样本中未知炎症分级的牙髓细胞的快速鉴定。
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