牛IVF是动物繁殖生物技术领域的研究热点之一。近年来,国内外学者对此进行了大量研究,但由于一些关键技术尚不完善,使其总体生产效率不高,严重制约了该技术在生产中的应用。卵母细胞及胚胎的体外培养条件和冷冻方法不够完善是其主要的限制因素。因此,本课题拟通过对影响牛卵母细胞IVF后胚胎发育的培养条件和冷冻方法等相关因素之研究,优化卵母细胞和胚胎的培养条件和冷冻方法,建立一套更加有效、可操作性强的胚胎体外培养和冷冻体系,提高IVP胚胎的生产效率。1输卵管和颗粒细胞单层对牛体外受精胚胎发育的影响以屠宰场牛卵巢为实验材料,研究了输卵管细胞单层(OCM)和颗粒细胞单层(GCM)对牛卵母细胞体外成熟(IVM)、体外受精(IVF)和体外培养(IVC)后胚胎发育能力的影响。实验1:从卵泡抽取卵丘卵母细胞复合体(COCs),并根据卵母细胞外面卵丘细胞的层数将其分为3级:1级(≥4层);2级(2～3层);3级(0～1层)。然后,分别进行在IVM和IVC培养液中添加GCM (1×106个/ml)与不添加的对比实验。结果显示:添加GCM对1级卵母细胞的卵裂率、6～8细胞发育率和囊胚率无明显影响(P>0.05);但添加GCM的2级、3级卵母细胞,受精后的卵裂率、6～8细胞发育率和囊胚率分别高于未添加组(P<0.05)。实验2:所有卵母细胞(包括COCs和裸卵)被随机分为3个组,在其IVM和IVC培养液中分别添加OCM、GCM或不添加体细胞(对照组)。结果显示:OCM和GCM组的卵裂率、6～8细胞发育率和囊胚率均高于对照组(P<0.05),而两实验组之间差异不显著。实验3:将取自每头牛的约20枚卵母细胞,分别置于不同大小的微滴(30μL,50μL,100μL和200μL)中培养、受精,结果表明,30μL和50μL组的囊胚发育率明显高于100μL和200μL组(P<0.05)。2卵泡及卵泡液对牛卵母细胞体外受精后发育的影响以屠宰场牛卵巢为材料,研究了卵泡大小和卵泡液对牛卵母细胞体外成熟、受精和培养后发育潜力的影响。实验1:按照卵泡大小将COCs分为4个实验组:>8 mm组、2～8 mm组、腔前卵泡(PF)卵母细胞组和混合(将前三种卵母细胞混合)组。结果表明,卵泡大小直接影响卵母细胞受精后的发育,同时,源自不同大小卵泡的卵母细胞混合培养,可以促进未成熟的腔前卵泡内卵母细胞的发育。实验2:将源自优势卵泡(>8 mm)、小卵泡(2～8 mm)和混合(所有卵泡液混合)的牛卵泡液(BFF),按照10%添加到成熟培养液中,3个实验组的卵裂率和囊胚率均高于没有添加BFF的对照组(P<0.05),但添加10%的优势卵泡液使卵母细胞和胚胎发生粘连,易于造成丢失。实验3:与未添加BFF的对照组相比,成熟培养液中分别加入10%、20%和40%的混合BFF,均可明显促进卵母细胞受精后的发育(P<0.05),但20%组和40%组出现卵母细胞间及胚胎间的粘连。因此,成熟培养液中添加10%的混合BFF较为适宜。3改进V形孔培养法对牛胚胎体外生产效果的影响研究目的在于探索三种不同培养方法对牛胚胎体外生产效果的影响。V形孔(WOW)培养微滴的制作方法是,在塑料培养皿的底部,相距1cm用加热的针头烫出V形孔,每个V形孔上覆盖一个20μL的培养微滴;改进的V形孔(mWOW)培养微滴制作方法与V形孔法基本相同,但V形孔间相距1mm,每15～20个V形孔上覆盖一个400μL的培养微滴。将卵母细胞和受精卵分别采用微滴(对照)、V形孔和改进的V形孔法进行体外培养,对照组每个微滴中植置入20～25枚卵母细胞或胚胎;二实验组每个V形孔中置入一个卵母细胞或胚胎。结果表明,mWOW组的卵裂率、囊胚率及第6d、7d、8d胚胎的总细胞数与微滴组差异不显著(P>0.05),但明显高于WOW组(P< 0.05);WOW组胚胎的孵化率低于mWOW组和对照组(P< 0.05),但mWOW组与对照组差异不显著(P>0.05)。此外,三组中第6d、7d、8d获得囊胚的总细胞数均呈现逐渐下降趋势。结论:以TCM-199为基础培养液,用改进的V形孔法可以完成牛胚胎体外生产的全过程,且比V形孔法培养的胚胎具有更强的发育能力和更好的质量。体外培养时,发育越快的胚胎质量越高。4牛未成熟卵母细胞冷冻方法研究通过对比冷冻保护剂浓度变化和不同玻璃化冷冻方法对卵母细胞冷冻效率的影响,探索牛未成熟卵母细胞的冷冻方法。实验1:将COCs分别在不同玻璃化冷冻液VS1 (10% EG + 10% DMSO)、VS2(20% EG + 20% DMSO)、VS3(25% EG + 25% DMSO)中存留30s或60s,体外成熟22h后,成熟率与对照组没有明显差异(P>0.05);但在VS3中存留60s时,成熟率明显下降(P<0.01)。说明当EG和DMSO浓度在冷冻液中各达到25%、作用时间增加到60s时,对卵母细胞有明显的毒性。实验2:在不同玻璃化冷冻液(VS1、VS2、VS3)中,采用OPS法冷冻COCs,解冻后再进行IVM、IVF和早期胚胎的IVC。结果表明,VS2组卵母细胞成熟率(67.9%)和囊胚率(5.4%)分别高于VS1组(61.1%; 0)和VS3组(63.6%; 3.6%)。实验3:分别采用细管法和开放式拉长细管(open pulled straw,OPS)法对未经成熟培养的卵丘卵母细胞复合体(COCs)进行玻璃化冷冻,解冻后再进行IVM、IVF和早期胚胎IVC。结果表明,细管组和OPS组的解冻后COCs正常率分别为59.4%±4.3和77.9%±4.1(P<0.01);成熟率分别为48.2%±5.3和66.0%±5.8(P<0.01);卵裂率分别为18.5%±2.0和32.8%±1.4(P<0.01);8-细胞阶段的成功率分别为14.8%±2.5和24.8%±1.5(P<0.01);桑椹胚发育率分别为0和5.3%±1.1,明显低于未经冷冻的鲜卵组(21.0%±3.8;P<0.01);囊胚发育率分别为0和4%±1.0,明显低于鲜卵组(P<0.01)。结论:以20%乙二醇和20%二甲基亚砜为冷冻保护剂,将室温下卵母细胞与冷冻液接触时间控制在30s以内,采用OPS法可以使未经成熟培养的牛COCs冷冻后获得桑椹胚和囊胚,但成功率低。5封闭式拉长细管法冷冻牛IVF胚胎研究本研究目的在于评价封闭式拉长细管(closed pulled straw,CPS)法对体外生产和体内获取牛胚胎的冷冻效果。在OPS玻璃化冷冻法的基础上,将其顶端热封以避免胚胎及冷冻液与液氮的直接接触,形成CPS玻璃化冷冻法。将体外生产或体内获取的牛桑椹胚和早期囊胚分别采用慢速冷冻法、OPS法和CPS法冷冻,解冻后对胚胎进行形态学鉴定,对形态正常胚胎分别进行体外培养24h和72h。结果表明:体外生产的牛胚胎,OPS组和CPS组的解冻后胚胎形态正常率分别为87.9%±5.2和85.4%±4.9,培养24h后的存活率分别为58.0%±6.8和56.3%±4.4,培养72h后的存活率分别为35.2%±6.0和34.9%±6.7,差异均不显著(P>0.05);但OPS和CPS法上述三项指标均显著高于慢速冷冻法(对照组,P<0.05)。体内获取胚胎的实验结果(实验2)与体外胚胎(实验1)基本一致。结论:CPS玻璃化冷冻法适用于体外生产和体内获取的牛胚胎冷冻。这种方法不仅可以降低胚胎被液氮污染的风险,而且保留了OPS玻璃化冷冻的优点。