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蛋白酶抑制剂基因已经在植物抗虫基因工程上得到了广泛的应用,有关它们在植物发育方面的生理功能的研究近年来也引起了越来越多研究者的关注。本研究通过农杆菌介导的方法,分别将SaPIN2a基因的过量表达载体和:RNA干涉载体导入到龙葵中,对转基因植株的T<,1>代进行Northern blot,Western blot和胰蛋白酶抑制剂活性分析证明在转基因龙葵中分别实现SaPIN2a的过量表达和基因沉默。
通过对T<,1>代转基因植株的表型分析以及光镜和电镜观察获得以下结果:
1.过量表达SaPIN2a的龙葵与野生龙葵相比株型矮化,节间距缩短,茎变细,表现出生长上的劣势,开花期没有明显差别;而SaPIN2a基因沉默的龙葵株高,节间距,茎的粗细与野生龙葵相比没有明显的差别,但是开花期提前。表明SaPIN2a的过量表达抑制了龙葵的生长,但是SaPIN2a的沉默表达对龙葵的生长没有负面影响。表明SaPIN2a的过量表达会抑制龙葵的生长发育。
2.通过光镜和透射电镜观察发现过量表达SaPIN2a蛋白的龙葵中,其茎韧皮部中出现了较多的未成熟的筛分子,部分筛分子出现退化,在一些筛分子中出现类似叶绿体的细胞器,还出现了个别的未成熟的导管分子。SaPIN2a沉默表达的龙葵茎中韧皮部筛分子发育正常,而且筛分子的发育较野生龙葵迅速。表明SaPIN2a可能参与了龙葵筛分子选择性自体融解过程的负调控。
3.详细研究了双链RNA在转RNA干涉/F4kpARTSa 默载体龙葵中的剪切模式。首次通过体内实验证明双链RNA的切割形成siRNAs不依赖其靶分子的存在;用于介导发夹结构双链RNA形成的Pdk内含子在转基因沉默的龙葵中没有被完全剪切,但是并不影响沉默现象的发生及沉默效率;同时建立了一种富集效率达到18%小分子量RNA的富集方法,比常用试剂盒的10%富集效率高出接近一倍。