自然杀伤细胞（natural killer cell,NK）是机体天然免疫系统的重要组成部分,在监视肿瘤早期恶性转化、清除病毒及感染细胞、调控免疫系统反应等过程中具有关键作用。NK细胞的失能会导致肿瘤的恶化以及转移增加,而NK的过度活化则是导致类风湿性关节炎、系统性红斑狼疮等自身炎症免疫性疾病发生的重要原因。因此,探究NK细胞发育和功能的调控机制对于理解多种疾病的发生,提出以NK细胞为干预靶点的临床研究方向和治疗策略,具有十分重要的意义。NK细胞发育和功能的调控主要依赖于来自外源性和内源性因子的调控作用:外源性的因子主要包括IL-2、IL-15、IL-12、IL-18、TGF-β等细胞因子以及氨基酸、葡萄糖等代谢物质;内源性的因子主要包括Foxo1、GATA-3、TOX、Tbx-21、Eomes、IRF2等转录因子。最近几年,研究者们发现NK细胞的发育和功能还与其代谢状态紧密相关,在NK细胞发育成熟的过程中,其代谢水平会逐渐降低,而当NK受到细胞因子、肿瘤或者病毒等刺激而活化时,其代谢水平会显著增强;相反,抑制NK的代谢会导致其发育受阻,活化能力受损。在哺乳动物细胞中,调控细胞代谢水平最重要的途径是以mTORC1（以Raptor为核心的蛋白复合体）和mTORC2（以Rictor为核心的蛋白复合体）两个复合体为核心的mTOR信号通路。mTOR信号通路能对细胞外界环境的变化做出快速响应,并有效调控细胞内营养代谢和物质合成的过程,以保证细胞的正常生存和生长。目前已经发现,mTOR信号通路的异常参与多种人类疾病的发生,包括肿瘤,肥胖,II型糖尿病和神经退行性疾病等。在NK细胞领域,最近有研究初步发现,用mTORC1的小分子抑制剂雷帕霉素处理或者将mTOR信号通路整体敲除,会降低NK细胞对细胞因子IL-15的反应性,影响NK细胞的发育和功能。但是用雷帕霉素抑制剂处理的方式会广泛影响各种细胞中mTORC1的活性,可能由此对NK细胞产生间接的影响,而且雷帕霉素对mTORC1通路的特异性也一直受到质疑,因此雷帕霉素处理并不能准确反映生理情况下mTORC1对NK细胞发育和功能的影响,而将mTOR整体敲除的方式只能笼统得同时抑制mTORC1和mTORC2的活性。因此,mTOR信号通路对NK细胞的调控作用仍然有诸多关键问题尚待阐明:比如mTORC2信号通路在NK细胞中有什么作用,其发挥功能的机制是什么?mTORC2和mTORC1对NK细胞的调控作用有什么异同点,它们之间有没有联系,这种相互联系的意义是什么。基于以上问题,在本研究中,我们构建了能够在NK细胞中特异性敲除mTORC1和mTORC2信号通路的转基因小鼠模型,深入研究了mTORC1和mTORC2对NK细胞发育和功能的调控特点以及之间的相互联系,并且揭示了它们发挥调控作用的具体机制,为靶向NK细胞中mTOR信号通路的抗肿瘤免疫疗法提供了新的思路。方法和结果:在本研究中,我们将Vav1-Cre和Ncr1-iCre工具鼠与Rictor^fl/fl或者Raptor^fl/fl小鼠杂交,构建了能够在NK细胞中特异性敲除Rictor蛋白的动物模型(Vav-Cre⁺/Rictor^fl/fl和Ncr1-iCre⁺/Rictor^fl/fl小鼠,分别表示为Rictor^?/?和Rictor^?NK),在NK细胞中特异性敲除Raptor的动物模型(Ncr1-iCre⁺/Raptor^fl/fl小鼠,表示为Raptor^?NK)以及在NK细胞中将Rictor蛋白完全敲除的基础上再将Raptor蛋白半敲的动物模型(Ncr1-iCre⁺/Rictor^fl/fl/Raptor^fl/wt小鼠,表示为Rictor^?NKNK Raptor^fl/+)。在转基因小鼠模型的基础上,我们采用了以流式细胞检测及分选为主的实验技术,进行了一系列体内外实验,得到了以下研究结果:1.mTORC2信号通路参与维持NK细胞的发育成熟。我们发现Rictor^?/?小鼠骨髓NK细胞的谱系特异性分化受到阻碍,Rictor^?/?或Rictor^?NK小鼠脾脏中NK细胞的比例和数量都显著降低,而在各个器官中,NK细胞的发育状况都受到了显著阻滞,尤其是最成熟的CD27^-CD11b⁺细胞亚群的比例显著降低。2.mTORC2信号通路负向调控NK细胞的效应性功能。我们将Rictor^?/?或Rictor^?NK小鼠脾脏细胞或分选的NK细胞亚群分别在体外与靶细胞共培养后,流式检测显示Rictor敲除的NK细胞CD107a的表达水平更高,荧光实验检测显示NK细胞对靶细胞的体外直接杀伤效率更高;而Rictor^?/?和Rictor^?NK小鼠对体内肿瘤也有更高的清除效率;另外Rictor敲除的NK细胞表达更多的细胞毒性分子以及更多的代谢相关指标。3.mTORC1信号通路正向调控NK细胞的发育成熟与效应性功能。Raptor^?NK小鼠NK细胞的比例和数量在骨髓中都有显著增加,然而在脾脏中却显著降低。在各器官中,NK的发育状况都受到了显著阻滞,表现为最成熟的CD27^-CD11b⁺细胞亚群的比例显著降低而不成熟的CD27⁺CD11b^-细胞亚群的比例显著增加。在功能方面,Raptor敲除后,并不影响能分泌IFN-γ的NK细胞的比例,但是降低了单个细胞的分泌量;另外,NK细胞在体外被靶细胞刺激后,CD107a的表达水平显著下降;Raptor^?NK小鼠体内清除肿瘤细胞的能力受到明显抑制;NK细胞中毒性分子以及代谢相关指标的表达水平也显著下降。4.NK细胞中mTORC1和mTORC2信号通路之间存在相互调控作用。我们发现,正常的人和小鼠NK细胞用细胞因子IL-15刺激后,细胞内mTORC1和mTORC2信号通路活性随着刺激时间延长都会出现先升高后降低的一致性变化。另外,在Raptor敲除的NK细胞中,我们发现P-AKT^ser473的表达水平显著降低,这可能是由于NK细胞表面CD122的表达水平降低,导致NK细胞对IL-15刺激的反应性降低导致的;相反,在Rictor敲除的NK细胞中,我们发现p-S6的表达水平显著升高,同时用IL-15刺激后,p-S6的水平升高的幅度更加明显。5.mTORC1和mTORC2信号通路对NK细胞的发育有非冗余的调控作用。为了进一步探究mTORC1和mTORC2信号通路之间的相互调控作用,我们构建了Rictor^?NKRaptor^fl/+小鼠模型。我们发现,相对于Rictor^?NK小鼠,Rictor^?NKRaptor^fl/+小鼠各器官中NK细胞的比例和数量进一步降低,发育状况被进一步阻滞,这些结果提示我们,mTORC1和mTORC2信号通路对NK细胞的发育过程有相对独立的调控机制。为了阐明这一机制,我们检测了Rictor^?/?、Raptor^?NK以及Rictor^?NKRaptor^fl/+小鼠NK细胞中调控其发育的关键转录因子Tbx21和Eomes的表达水平:Rictor敲除的NK细胞中,Tbx21的表达水平显著下降,而Eomes的表达水平没有变化;Raptor敲除的NK细胞中,Tbx21和Eomes的表达水平都有显著下降;而在Rictor全敲的基础上再将Raptor半敲,Tbx21的表达依然降低,Eomes的表达水平依然没有变化。这表明mTORC1和mTORC2信号通路对Tbx21和Eomes的表达既有共同的调控作用,又有相对独立的影响,是一种非冗余的调控方式。6.mTORC2通过抑制mTORC1信号通路活性进而抑制NK细胞的效应性功能。为了探究在NK细胞中,mTORC2信号通路对功能和代谢水平的抑制与其对mTORC1信号通路活性水平的抑制作用是否有联系,我们检测了Rictor^?NKRaptor^fl/+小鼠NK细胞的功能水平,结果显示,Rictor^?NKRaptor^fl/+小鼠NK细胞的细胞毒性分子和代谢相关指标的表达水平与Rictor^?NK小鼠NK细胞相比有显著降低,基本与对照的表达水平一致;但是CD107a的表达水平仍然相比对照有升高的趋势。用低浓度雷帕霉素处理Rictor敲除的NK细胞,使其mTORC1的活性降至与WT的NK细胞相当的水平,也可以观察到与前面类似的现象。7.NK细胞中mTORC2信号通路抑制mTORC1信号通路活性的机制。我们通过检测p-AKT^Thr308的表达水平以及使用AKT抑制剂处理的方式,发现PI3K-AKT信号通路不参与Rictor对mTORC1通路的负向调控。NK细胞中,Rictor敲除后,虽然细胞表面CD122的表达水平没有变化,但是细胞内部p-STAT5的水平显著升高,而且用p-STAT5的特异性抑制剂处理Rictor敲除的NK细胞,可以显著降低其p-S6表达水平,同时降低其功能相关指标的表达水平。而为了进一步探究NK细胞中p-STAT5正向调控mTORC1信号通路活性的机制,我们检测了细胞表面SLC7A5受体的表达（SLC7A5表达受p-STAT5转录调控,且影响细胞中mTORC1通路活性）,结果显示Rictor敲除后,NK细胞表面SLC7A5蛋白的表达水平显著升高,且用p-STAT5抑制剂处理后可以逆转其升高的趋势;而用SLC7A5的特异性抑制剂BCH处理Rictor敲除的NK细胞,可以逆转其细胞内部mTORC1信号通路升高的水平。研究结论:1.NK细胞中mTORC1和mTORC2信号通路通过调控Tbx21和Eomes的表达,以一种既相互协同,又相对独立的非冗余方式调控NK细胞的发育成熟。2.mTORC1信号通路促进NK细胞的效应性功能和能量代谢过程,而mTORC2信号通路则抑制效应性功能和代谢。3.NK细胞中,mTORC1信号通路通过维持CD122-IL15途径的活性来调控mTORC2通路的活性,而mTORC2信号通路则通过抑制p-STAT5诱导的SLC7A5表达来抑制mTORC1通路的活性,进而抑制NK细胞的效应性功能和代谢水平。总之,我们的研究揭示了NK细胞中mTORC1和mTORC2信号通路之间的相互调控作用,阐明了NK细胞发育和活化的过程中mTORC1和mTORC2动态调控的机制,并且拓宽了对NK细胞中mTOR和STAT5信号通路相互联系的认识。尤其是,我们的研究提出了通过靶向性抑制NK细胞中mTORC2信号通路活性,增强其效应性功能的思路,为NK细胞的抗肿瘤免疫治疗研究提供了新的策略和方向。