背景：　　急性呼吸窘迫综合综（acute respiratory distress syndrome，ARDS）患者通常需要人工通气辅助治疗以改善氧合。而机械通气治疗 ARDS过程中常常会引发呼吸机相关性肺损伤(Ventilation induced lung injury，VILI)，且与之相关的死亡率高达34~60％。机械通气导致肺损伤的主要作用机制包括：气压伤、容积伤、萎陷伤、生物伤。不适当的机械通气导致肺泡上皮细胞和毛细血管内皮细胞受损、毛细血管基底膜暴露,引起局部炎症细胞激活和炎症反应放大,诱导或加重肺损伤,即生物伤。目前防治VILI的策略方面还不够完善。主要针对其发生机制采取保护性通气策略。虽然一定程度降低了ARDS的病死率，但ARDS病死率仍然较高，急需对VILI发生、发展的具体分子调节机制进行探讨，以期找出新的防治策略。　　肺泡 II型上皮细胞是机械通气损伤的主要靶点之一,是机械力造成肺部生物伤的始动环节。肺泡II型上皮细胞作为一种组织干细胞，具有十分重要的功能，能够分泌抗炎、抗菌物质，因此深入研究机械通气对肺泡 II型上皮细胞功能的影响，有助于明确VILI所致炎性反应发生、发展的具体分子调节机制。　　近年来，大量研究证实，miRNA参与了免疫反应调控。深入探索肺泡 II型上皮细胞miRNA对免疫系统的调节机制,不仅能明确miRNA的在各炎症通路的调节作用,而且能在基因调控层面对呼吸机相关性肺损伤的防治提供新的线索。　　目的：　　建立原代人肺泡 II型上皮细胞分离培养及鉴定的方法；机械牵张原代人肺泡II型上皮细胞建立miRNAs差异表达谱，找出显著差异表达的miRNA。　　方法：　　1、原代人肺泡 II型上皮细胞的分离培养及鉴定：以肺叶切除患者的肺组织作为组织来源，首先用胰酶与弹性蛋白酶联合法消化成人非肿瘤的边缘肺组织，再经细胞筛过滤、差速贴壁、梯度分离液分离以及Anti-CD14磁珠分选纯化细胞，然后将得到的细胞进行培养。通过 RT-PCR检测特异性基因的表达，pro-SP-C、CK-8双标免疫荧光染色、LysoTracker? Green DND-26荧光分子探针染色、透射电镜观察细胞的超微结构进行细胞鉴定；同时用pro-SP-C、DND-26着色情况评估细胞纯度。　　2、细胞表型维持及反应性检测：运用不同培养基与不同血清浓度的组合，研究其对细胞表型维持的影响；运用RT-PCR监测培养过程中代表肺泡II型上皮细胞表型的基因（SP-A，SP-B，SP-C，SP-D，CK-8，KL-6，AQP-3）的表达变化，评估体外培养的肺泡II型上皮细胞生物学特性的维持情况；并运用RT-PCR、ELISA法检测 TNF-a刺激原代培养的肺泡 II型上皮细胞相关炎症因子（IL-6，IL-8，MCP-1，ICAM-1）的表达情况来观察其反应性(n=3)。　　3、机械牵张人肺泡 II型上皮细胞构建 miRNAs差异表达谱：分离培养原代人肺泡 II型上皮细胞，以5.5×105个/孔接种牵张板（BF-3001C），周期性牵张，减速波（DC%=50%），%Elongation=0%、5%或20%，作用时间30h，每组设一个复孔。处理完成后，以1ml/孔TRIzol试剂收集3组样品总RNA于1.5mlEP管中，-70℃保存。由康成生物技术有限公司进行 miRNAs芯片分析，建立芯片差异表达谱（n=3）。　　结果：　　1、原代人肺泡 II型上皮细胞的分离培养及鉴定：运用这种方法，每克边缘肺组织经分离、纯化后平均可获取ATⅡ细胞为6×105-1×106（n=36），pro-SP-C和Lysotrack? Green DND-26染色评估细胞纯度可达(98土2)％（n=36），0.4％台盼蓝染色评估细胞的活力为(96土2)％（n=36）。pro-SP-C、CK-8双标免疫荧光、Green DND-26荧光分子探针、透射电镜均证实该方法培养的细胞为肺泡II型上皮细胞。　　2、细胞表型维持及反应性检测：通过比较不同培养基以及血清浓度对ATII细胞的影响，发现10%FBS或DMEM均不适合维持细胞的表型，而SAGM+1%FBS能较好地维持细胞表型。Cytokeratin-8和KL-6作为上皮细胞标志性蛋白表达持续性较好。更重要的是SP-A,SP-B，SP-C,SP-D持续表达超过20天，尤其是SP-B，SP-D在培养的第28天时仍然有明显表达。代表肺泡II型上皮细胞表型的AQP-3也持续表达超过20天,同时代表肺泡I型上皮细胞表型AQP-5始终为低表达。用不同浓度的TNF-a处理原代培养的肺泡II型上皮细胞的结果表明,炎症因子(IL-6，IL-8，MCP-1，ICAM-1) mRNA表达水平随着 TNF-a刺激强度的增加而增多；而且用ELISA方法在细胞培养上清中也观察到了同样的现象。　　3、机械牵张肺泡II型上皮细胞构建MicroRNAs差异表达谱：经过一系列筛选之后,共有112个可纳入进一步的数据比较分析，其中A20/A0有49个上调、63个下调，A5/A0有13个上调、15个下调。上调最高可达104.8倍，下调最高可达57.1倍。　　结论：　　成功建立分离纯化、原代培养及鉴定人肺泡II型上皮细胞的方法，其表型维持在28天以上；成功构建了机械牵张原代人肺泡II型上皮细胞MicroRNAs差异表达谱。本研究为进一步探讨miRNA在呼吸机相关性肺损伤中的调节作用提供了重要线索。