水稻(Oryza sativa L.)不仅是世界上最重要的粮食作物之一,也是需水量最大的作物。迄今为止,水稻抗旱性研究在遗传水平和抗旱性品种选育上都取得了较大的进展。但是水稻抗旱性是一个极其复杂的数量性状,单个或者有限几个基因的育种价值有限。以往,这些基因的研究只涉及到DNA序列变化,对于DNA一级结构不发生变化而基因表达却发生可遗传变化以适应干旱环境的表观遗传机制在水稻抗旱研究中较少涉及到。本研究中,将一个节水抗旱品种沪旱3号及一个旱敏感品种II-32B在自然旱田条件下连续种植了11代,获得了两个经多代干旱驯化的表观突变积累系。因为每个表观突变积累系来源于同一个亲本,所以每一世代都有高度一致的遗传背景,它们的表型差异、生理生化特征差异都应来自于表观遗传机制调控的基因表达差异。对经6代干旱驯化后的世代(G6)和经11代干旱驯化后的世代(G11)与原始世代(G0)在抗旱性以及DNA甲基化模式上的差异进行鉴定,深入研究了多代干旱驯化对栽培稻抗旱性、DNA甲基化模式和基因表达的影响。主要结果如下:1.经连续多代干旱驯化后,沪旱3号和II-32B两品种后代相对于G0的分蘖数显著降低,,而结实率和千粒重却增加,同时单分蘖对应的深根体积和深根重也增加。推测两品种为应对干旱驯化采取的策略是:减少穗数(分蘖数)并增加深根吸水用以维持植株存活,通过提高结实率和粒重尽量保持产量不降低。2.256对MSAP引物组合分别在II-32B和沪旱3号中检测了3070和4739个CCGG位点的甲基化状态。II-32B未甲基化位点占56%以上,沪旱3号未甲基化位点占65%以上。II-32B的甲基化水平约为39%,沪旱3号的甲基化水平约为31%。不考虑世代差异及胁迫处理差异的条件下,II-32B未甲基化位点比例显著低于沪旱3号(P<0.01),而半甲基化位点比例和超甲基化位点比例都显著高于沪旱3号(P值分别为P<0.01和P<0.05)。3.在II-32B中,13.10%(402/3070)的检测位点DNA甲基化在世代之间和/或处理之间有差异。在沪旱3号中,这一比例为1.77%(84/4739)。沪旱3号的甲基化变化位点数目和比例都比II-32B低,这表明沪旱3号比II-32B的甲基化组更稳定。4.在两水稻品种中,胁迫处理前后发生甲基化变化的都主要是G6世代。G0和G6之间的甲基化差异主要发生在正常生长条件下。这表明G6的甲基化组相对于G0变的更不稳定,当再次遭受干旱胁迫时,G6世代可能发生更多的甲基化变化来适应改变的环境。5.II-32B中27.61%(111/402)的差异甲基化位点(DMLs)是由干旱定向诱导产生的,其中11.71%(13/111)干旱胁迫定向诱导的DMLs在后代中保持稳定。在沪旱3号中,比例分别为47.62%(40/84)和62.50%(25/40)。这表明,II-32B的DNA甲基化变化大部分都是随机发生的且不能稳定遗传;而在沪旱3号中,一半以上的DML是干旱胁迫定向诱导的,且大部分可在后代中保持甲基化状态稳定。这意味着多代干旱驯化对沪旱3号的影响比对II-32B的影响更大。6.DNA甲基化变化位点在在全基因组12条染色体上都有分布,大部分发生在基因的启动子区和外显子区。在沪旱3号和II-32B中,分别有62.73%和45.00%的DML相关基因为功能基因。GO分析发现部分基因直接参与胁迫反应通路。为研究经11代干旱驯化对两栽培稻品种成株期DNA甲基化模式的影响,我们利用全基因组重亚硫酸盐测序(WGBS)的方法检测经11代干旱驯化后沪旱3号和II-32B的DNA甲基化变化情况。每个品种检测了16个样品,包括4个世代(G0、G10、G11和G10R1—G10在正常水分条件下恢复一个世代)、2种处理(正常水分条件和干旱胁迫处理)以及每样本设置了2个生物学重复。主要结果如下:1.沪旱3号和II-32B各16个样品的基因组平均测序深度分别为28.82×和24.54×,链特异性平均测序深度分别为13.45×和11.21×,分别覆盖了参考基因组84.64%和76.42%的胞嘧啶位点。2.在两个水稻品种中,基因体和转座子元件上的CG甲基化水平在不同世代之间或不同处理之间都比较稳定,变化较小,而CHG和CHH序列的甲基化水平变化较大,说明CG甲基化状态比非CG序列甲基化状态稳定。值得注意的是,沪旱3号各序列DNA甲基化变异幅度都小于II-32B的各序列,说明遭受干旱胁迫时沪旱3号比II-32B有更稳定的甲基化组。3.干旱胁迫诱导的表观突变并不是随机出现的,而是存在一些热点。在沪旱3号中,hypo-methylated DMPs(差异甲基化位点)和hyper-methylated DMPs重复事件频率分别是3.76%和6.45%;在II-32B中,这些频率分别是2.78%和5.79%。无论是沪旱3号还是II-32B,DMPs重复事件出现的频率远大于假设它们是随机发生的频率。在SMPs(单胞嘧啶甲基化多态性位点)中,也观察到相似的结果。4.根据干旱胁迫诱导的表观突变对两品种不同世代进行聚类分析发现,多代干旱胁迫对这些表观突变位点的DNA甲基化状态有很大影响,且这种影响是定向的。5.部分经10代干旱驯化后“积累的”表观突变能稳定遗传给后代。在沪旱3号中,9.39%的“积累的”DMPs能将它们经驯化后改变的DNA甲基化状态传递给子代;在II-32B中,这一比例为7.51%。对于SMPs而言,在沪旱3号中,14.86%的“积累的”SMPs能将它们经驯化后改变的DNA甲基化状态传递给子代;在II-32B中,这一比例为15.60%。Gene Ontology分析发现,14.04%-19.19%的可遗传的表观突变位点相关基因直接参与胁迫反应相关通路。6.在干旱胁迫条件下,在沪旱3号和II-32B中,分别有68.44%和71.14%的可能受干旱胁迫诱导的DMPs能在后代中保持它们改变的DNA甲基化状态。另外,两品种分别有44.80%和71.14%的可能受干旱胁迫诱导的SMPs能在后代中保持它们改变的DNA甲基化状态。7.启动子区域的DMRs甲基化状态与基因表达并没有明显相关性,基因体上的DMRs甲基化状态与基因表达成正相关。MSAP和WGBS结论都表明,多代干旱驯化诱导两栽培稻品种发生全基因组的DNA甲基化变化,且旱敏感品种的基因组变化幅度大于抗旱性品种。在两品种中,某些特定位点的DNA甲基化变化受干旱胁迫定向诱导且部分位点的能将它们改变的DNA甲基化状态稳定遗传给子代。部分可遗传的表观突变位点相关基因直接参与胁迫反应相关通路,表明DNA甲基化在植物抗旱性中起重要作用。